長鏈非編碼RNA-ROR在乳腺癌診斷中的潛在應用研究

曹鳴菲，雷德財，宋曉玉，吳立春△

(1.簡陽市川空人民醫院檢驗科，四川簡陽 641400;2.四川省腫瘤醫院檢驗科，四川成都 610041)

長鏈非編碼RNA-ROR(lincRNA-ROR)首次是在多能干細胞誘導研究中發現的，是一個新的上皮-間質細胞轉換誘導因子，能誘導乳腺上皮細胞產生干細胞樣細胞并促進乳腺癌的轉移，其表達水平與乳腺癌呈正相關[1-2]。本研究擬通過q-PCR方法，觀察lincRNA-ROR在乳腺癌組織和外周血清中的表達差異，旨在為乳腺癌早期篩查、診斷治療及預后判斷提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究所有組織均來源于四川省腫瘤醫院2017年1月至2018年12月行手術治療患者術中切除的新鮮組織，收集其中配對的乳腺癌病理組織及其癌旁組織共計30對，樣本均來源于簡陽市川空人民醫院術前臨床診斷乳腺癌，術后病理確診為乳腺癌患者，患者平均年齡(48.23±5.18)歲，并留取其手術前后1周的外周血液。與此同時，收集同期150例疑似乳腺癌病例，術中冰凍切片病理報告和術后石蠟切片病理確認為乳腺癌女性患者的有效新鮮血清，采血前均未進行任何臨床治療，其中早期乳腺癌患者50例，150例疑似乳腺癌患者平均年齡(47.84±6.34)歲。另選擇體檢健康者150例，平均年齡為(47.22±5.47)歲；乳腺良性疾病患者50例，患者平均年齡(48.12±5.83)歲。

1.2試劑與儀器 美國ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀器，日本島津UV-2450紫外分光光度計，美國Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像儀，昕慧XH600電泳分析儀，羅氏Cobas e601電化學發光全自動免疫分析儀。PCR引物、焦碳酸二乙酯(EDPC，上海生工生物工程有限公司)，組織RNA提取試劑盒TRIZOl、PrimeScriptTMRTⅡ逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqⅡ擴增試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)，外周血RNA提取試劑盒(Bioteke,北京百泰克生物技術有限公司)。

1.3方法

1.3.1樣本處理 所有組織樣本手術切除后置于經DEPC水處理的專用凍存管存放于-80 ℃冰箱備用；外周血液樣本分離血清上機檢測后保存備用。

1.3.2總RNA提取及cDNA的合成 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用bioteke法和Trizol法分別提取外周血清中的總RNA，再采用大連寶生物試劑盒(PrimeScriptTMRTⅡ)逆轉錄合成cDNA。

1.3.3內參選擇及引物設計 查閱相關文獻[2]并設計引物，引物信息見表1。

1.3.4lincRNA-ROR表達水平的檢測 q-PCR檢測擴增后SYBR?Gree的熒光水平，并采用2-ΔΔCt計算分析樣本中lincRNA-ROR的相對表達量，20 μL反應體系成分及用量見表2。

表2 20 μL反應體系成分及用量

1.3.5CEA和CA153水平檢測 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，運用羅氏Cobas e601電化學發光全自動免疫分析儀及其原裝試劑檢測外周血清中CEA和CA153的水平。

2 結 果

2.1總RNA提取及純度鑒定 要求RNA吸光度(A)260/A280為1.8～2.0，電泳條帶28S與18S亮度之比大概為2∶1，電泳圖譜見圖1。

圖 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2lincRNA-ROR在乳腺癌組織中的表達 熔解曲線呈單峰，擴增產物純度佳，無二聚體形成，得到相應Ct值，通過2-ΔΔCt方法計算得出：30例乳腺癌組織中的lincRNA-ROR表達水平顯著高于30例癌旁組織(2.46±0.99vs.0.83±0.37)，差異有統計學意義(t=10.78，P<0.000 1)。見圖2。

2.3lincRNA-ROR在乳腺癌外周血清中的表達 lincRNA-ROR在150例乳腺癌患者外周血清中的表達水平明顯高于150例體檢健康者(1.76±0.70vs. 1.04±0.46)，差異有統計學意義(P<0.000 1)。見圖3。

圖2 lincRNA-ROR在乳腺癌組織中的表達

圖3 lincRNA-ROR在外周血清中的表達

2.4lincRNA-ROR在乳腺良性疾病血清中的表達 lincRNA-ROR在50例乳腺良性疾病和50例體檢健康者間的表達水平差異無統計學意義(1.24±0.45vs. 1.12±0.37，P>0.05)。

2.5lincRNA-ROR對乳腺癌的早期診斷價值 選取50例早期乳腺癌患者(乳腺腫瘤直徑<3 cm，同側腋窩無淋巴結轉移，無遠處轉移)作為病例組，從150例體檢健康者血清中選取50例作為對照組，并采用化學發光法檢測CA153和CEA表達水平，對血清中的lincRNA-ROR、CA153和CEA繪制ROC曲線，結果顯示，lincRNA-ROR的曲線下面積(AUC)為0.758，明顯大于乳腺癌傳統標志物CA153(AUC=0.663，P=0.011)和CEA(AUC=0.516，P=0.002)；lincRNA-ROR在乳腺癌診斷中的靈敏度和特異度分別為80.0%和73.3%，均高于CA153(靈敏度為73.3%，特異度為60.0%)和CEA(靈敏度為66.7%，特異度為50.0%)。通過對血清中的lincRNA-ROR、CA153以及CEA建立多元Logistic回歸模型，發現3項指標聯合分析后AUC為0.846，聯合診斷效能優于3項指標單獨使用。見圖4。

圖4 lincRNA-ROR對乳腺癌的早期診斷效能

2.6lincRNA-ROR與乳腺癌實體腫瘤的相關性 通過對30例乳腺癌患者手術前和手術后1周的外周血清中lincRNA-ROR的表達水平予以檢測，檢測結果表明，術后lincRNA-ROR的表達水平(0.90±0.35)明顯低于術前(1.82±0.68)，差異有統計意義(t=6.58，P<0.001)。見圖5。

圖5 lincRNA-ROR與乳腺癌實體腫瘤的相關性

3 討 論

腫瘤的侵襲轉移是一個復雜的生物學進程[3-4]，傳統乳腺腫瘤標志物缺乏足夠的靈敏度和特異度，2007年美國臨床腫瘤學會(ASCO)不再推薦其作為早期乳腺癌的診斷和術后隨訪觀察指標[5]。新近研究顯示，lincRNA-ROR 在胃癌[6]、肝癌[7]、食道癌[8]、胰腺癌[9]、結腸癌[10]、膀胱癌[11]、鼻咽癌[12]、乳腺癌[2]中發揮著致癌作用，而在神經膠質瘤中發揮抑癌作用[13-14]。HOU等[2]研究發現，lincRNA-ROR表達水平與乳腺癌呈正相關，當沉默lincRNA-ROR時則抑制乳腺腫瘤形成和轉移，并通過miR-205/miR-145等實現對細胞分化、侵襲、轉移、凋亡等癌癥進程的調控。MA等[15]研究成果顯示，lincRNA-ROR在三陰乳腺癌的組織和細胞系中高表達，同時lincRNA-ROR作為miR-145的內源性競爭性RNA上調MUC1基因的相對表達量來影響E鈣蛋白的細胞膜定位，并通過lincRNA-ROR/miR-145信號通路促進三陰乳腺癌腫瘤細胞的侵襲和轉移[16-17]。應用AUC評價試驗診斷價值是現行公認的理想方法[18]，本研究通過繪制ROC曲線發現lincRNA-ROR相對于CEA和CA153具有更高的靈敏度和特異度，并且lincRNA-ROR、CEA和CA153聯合檢測效能得以顯著提高(AUC=0.846)，這表明血清中的lincRNA-ROR可能為乳腺癌診斷的一個潛在分子標志物。

近年來大量臨床藥物研究表明，高表達lincRNA-ROR可促進波形蛋白、神經型鈣黏蛋白的表達，抑制上皮黏蛋白的mRNA及其蛋白的表達，進而導致對5-氟尿嘧啶、紫杉醇、他莫昔芬、吉西他濱等藥物耐受，是乳腺癌化療、激素治療泛耐藥的一個分子標志物[19-21]。而體內外研究結果顯示,葡萄素通過LincRNA-ROR/miR-145/ARF6信號通路使乳腺癌細胞轉移相關蛋白Snail、波形蛋白、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9下調和上皮鈣黏附素表達上調，進而發揮出抑制乳腺癌細胞侵襲和轉移的能力，為臨床乳腺癌的治療提供了新的思路和依據[22]。前期有研究發現，lincRNA-ROR與乳腺癌患者的年齡、TNM分期、HER2、Ki67、部位(左側、右側、雙側)無關[23]。后期也有研究證實，linc-ROR rs4801078位點的等位基因與血液中Linc-ROR水平密切相關[24-25]，linc-ROR rs4801078 TT (OR=1.791,95%CI:1.195～2.683)基因型可以增加乳腺癌的發病風險；Linc-ROR rs4801078、懷孕次數、絕經狀態三者之間的交互作用亦可以增加患乳腺癌的風險[26]。

本研究進一步研究發現,lincRNA-ROR在乳腺癌患者術后顯著降低，同時在乳腺纖維瘤、乳腺增生等乳腺良性疾病患者血清中無明顯變化，這提示血清中lincRNA-ROR表達水平可動態反應乳腺癌患者體內腫瘤表達情況，通過對乳腺癌患者外周血清中lincRNA-ROR的表達水平監測，可以實現對乳腺癌患者手術效果評價和腫瘤復發的監控，進而更準確地預測乳腺癌治療效果，為臨床制訂乳腺癌診治策略的個體化及其預后隨訪的精準化提供強有力的指導。

4 結 論

LincRNA-ROR在乳腺癌患者組織和外周血液中表達上調，并具有良好的靈敏度和特異度，可作為乳腺癌早期篩查、診斷及預后判斷的一個新型分子標志物和治療的潛在靶標，但其在乳腺癌診治的臨床實用價值尚待進一步研究。