HIV/AIDS患者外周血中4種細胞因子IL-2、IL-4、IL-15和IL-21表達水平及其臨床意義研究

劉瓊華 劉志生 鄭煜煌 陳霞 賀波 鄭力文

〔摘要〕 目的 觀察外周血 4 種細胞因子（IL-2、IL-4、IL-15及IL-21）在HIV感染者/AIDS患者（HIV/AIDS）和正常人表達水平的區別及其與HIV RNA病毒載量和CD3+、CD4+細胞數量的相關性，分析其與HIV感染的關系和臨床意義。方法 40例未經抗病毒治療的HIV/AIDS 和31名正常人，采用ELISA法檢測外周血4種細胞因子（IL-2、IL-4、IL-15及IL-21），使用流式細胞計數法檢測外周血CD3+、CD4+ T 淋巴細胞數量，實時聚合酶鏈反應測定血清中HIV RNA水平。結果 未經抗病毒治療的HIV/AIDS外周血IL-2、IL-15及IL-21水平低于正常人，而IL-4水平高于正常人（P<0.05）。CD3+、CD4+細胞數量和各細胞因子水平顯示出一定的相關關系，IL-2和IL-15水平均與HIV-1 RNA載量呈負相關。結論 提示外周血4種細胞因子都可能參與了HIV感染的致病機制，并與HIV RNA病毒載量及CD3+、CD4+細胞數量相關。

〔關鍵詞〕 人免疫缺陷病毒;艾滋病;IL-2;IL-4;IL-15;IL-21

〔中圖分類號〕R512.91 ? ? ? 〔文獻標志碼〕B ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.018

〔Abstract〕 Objective To observe the differences of 4 cytokine levels between HIV/AIDS patients and normal persons， and their relevance with HIV RNA level and CD3+， CD4+ cell count， and to analyze the relationship with HIV infection and clinical significance. Methods A total of 40 HIV/AIDS patients without antiviral therapy and 31 normal persons were enrolled. Enzyme Linked Immunosorbent Assay （ELISA） was used to detect 4 cytokine levels （IL-2， IL-4， IL-15 and IL-21）. At the same time， the number of CD3+ and CD4+ T lymphocytes in peripheral blood was detected by flow cytometry， and the level of HIV RNA in serum was determined by real-time polymerase chain reaction. Results IL-2， IL-15 and IL-21 in peripheral blood of HIV/AIDS patients without antiviral therapy were significantly lower than that of the normal people， and IL-4 level was higher than the normal people（P<0.05）. The number of CD3+， CD4+ cells and the level of each cytokine showed a certain correlation， and IL-2 and IL-15 levels were negatively correlated with HIV-1 RNA load. Conclusion It is suggested that all 4 cytokines in peripheral blood may be involved in the pathogenesis of HIV infection and are related to HIV RNA viral load and the number of CD3+ and CD4+ cells.

〔Keywords〕 human immunodeficiency virus; AIDS; IL-2; IL-4; IL-15; IL-21

人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所致的艾滋病（AIDS）已成為危害人類健康和生命的嚴峻問題。至 2016年底全世界現存的HIV/AIDS達到3 670萬人。截止2016年6月底中國大陸活著的HIV/AIDS有65.3萬人，另有約20.1萬人死亡[1]。加強對HIV傳播和AIDS發病的預防與控制已成為急待解決的燃眉之急。高效抗逆轉錄病毒治療（HAART）能快速地抑制血液中的病毒，但無法根除細胞中的病毒儲存庫。近年來，科學家們已發現多種免疫細胞及其釋放的細胞因子參與了HIV/AIDS的發病機制，并和血漿HIV病毒載量及外周血CD3+、CD4+細胞數量相關。研究這些細胞因子在HIV感染者中的變化及其在AIDS發病過程中的作用，有可能為加強抗HIV病毒效果提供新的輔助治療途徑[2]，為最終根除AIDS提供可能性。本研究對比觀察了外周血4種細胞因子在HIV/AIDS和正常人表達水平的區別，及其與血漿HIV RNA病毒載量和外周血CD3+、CD4+細胞數量的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 ?研究對象

40例HIV/AIDS患者均選自中南大學湘雅二醫院感染科門診，并經過湘雅二醫院艾滋病研究室HIV抗體初篩實驗陽性和湖南省疾病預防控制中心HIV 抗體確認實驗陽性確證為HIV-1感染。其中，男性 26人，女性14人，年齡（37.8±10.1）歲，均符合我國2001年制定的《HIV/AIDS診斷標準及處理原則》中華人民共和國標準（試行）和中國疾病預防控制中心2016年頒發的《國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊》（第四版）的診斷標準;并從未使用過抗 HIV 藥物、無明顯艾滋病表現、無腫瘤發生，女性無妊娠，心肝肺腎功能基本正常。31名對照正常人均來自湖南省婁底職業技術學院醫學部。其中，男19人，女性12人，年齡（34.5±13.6）歲，身體健康，均檢測HIV抗體初篩實驗陰性，其余同HIV/AIDS組。本研究啟動前經湘雅二醫院醫學倫理委員會批準，并向研究對象說明實驗的意義、可能的副作用及其他注意事項，均簽署知情同意書。

1.2 ?外周血淋巴細胞亞群檢測和血漿HIV RNA定量檢測

40例HIV-AIDS患者以EDTA真空采血管采集靜脈血2 mL，每支試管各取100 μL全血分別加入CD3-PreCP、CD4-PE、CD8-PE熒光單克隆抗體（美國BD 公司），混合后置室溫避光孵育，加入溶血素再避光孵育，離心棄上清PBS洗滌2次，送FACS Calibur 型流式細胞儀（美國BD公司）檢測，以Cell Guest 軟件收集分析處理好的標本，分析 CD3+總T淋巴細胞數、CD3+、CD4+淋巴細胞數和CD3+、CD4+ 淋巴細胞數。離心分離的血漿置-80 ℃保存待測，HIV 核酸擴增熒光定量檢測（FQPCR HIV RNA）試劑盒（深圳市PG生物工程公司提供，國藥準字SZ20020041），Gene Amp 7300序列檢測系統（美國PE公司）。操作程序嚴格按照試劑盒說明書進行，定量線性范圍 50 拷貝/mL～1 000 000拷貝/mL。

1.3 ?外周血細胞因子的血清濃度檢測

使用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定40例HIV/AIDS和31名正常對照者血清中細胞因子的濃度。IL-2和IL-21試劑盒購自北京四正柏生物科技公司，IL-4試劑盒購自深圳晶美生物工程公司，IL-15 試劑盒購自美國R&D Systems公司。

1.4 ?統計學方法

采用Graphpad Prism 5統計軟件和Excel軟件進行分析。資料以“x±s”表示。計量資料符合條件（正態分布/方差齊性）者采用t檢驗，不符合條件者，采用Wilcoxon 秩和檢驗。運用SPSS 19.0統計軟件分析各變量的相關性，計算其相關系數及其P值，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ?外周血CD3+、CD4+細胞數量和血漿HIVRNA 定量檢測

40例未經抗病毒治療的HIV/AIDS患者外周血CD3+、CD4+細胞數量平均值為（194.98±95.25）個/μL，其中20例行血漿HIV RNA定量檢測，其log值的水平為（4.35±1.15）。做相關性回歸分析，二者呈負相關（r=-0.56，P=0.000）。見圖1。

2.2 ?HIV/AIDS血漿4種細胞因子水平與正常人的區別

40例HIV/AIDS的血漿IL-2、IL-15及IL-21水平低于正常人（t=2.690、2.550、2.780，P=0.001、0.022、0.000）;IL-4水平高于正常人（t=2.870，P=0.000）。見表1。

2.3 ?HIV/AIDS血漿4種細胞因子水平與CD3+、CD4+細胞數的關系

對40例HIV-AIDS患者血漿IL-2、IL-4、IL-15及IL-21的水平與外周血CD3+、CD4+細胞計數的相關性進行分析發現：IL-4水平與CD3+、CD4+細胞數量呈負相關（r=-0.48，P<0.01）;IL-2、IL-15與CD3+、CD4+細胞數量則呈正相關（r=0.36，P=0.002;r=0.52，P<0.001，r=0.68，P=0.017）。

2.4 ?HIV-AIDS血漿4種細胞因子水平與HIV RNA病毒載量的關系

20例HIV-AIDS做了血漿HIV RNA水平檢測， 其log值的水平為（4.35±1.15）。血漿IL-2、IL-4、IL-15及IL-21的水平與血漿HIV-1 RNA載量相關性分析顯示，IL-4和IL-21水平與血漿HIV- 1 RNA載量的相關性差異無統計學意義（r=0.213和-0.190，P=0.076和0.173）;而IL-2及IL-15水平均與HIV-1 RNA載量呈負相關（r=-0.33和-0.34，P=0.040和0.031）。

3 討論

研究表明，多種免疫細胞及其釋放的細胞因子在HIV感染機體后發生了顯著改變，而在接受 HAART治療的進程中這些變化得以不同程度矯正，反映這些細胞和細胞因子可能參與抗HIV的免疫應答過程，AIDS發病機制也與其有一定關系。挖掘這些細胞因子和HIV發病的內在聯系，揭露其對抗病毒治療的影響，極大可能為強化抗HIV病毒效果開辟嶄新的治療方向[1-2]。細胞因子廣泛作用于啟動、維持與調節免疫自身穩定和炎癥性過程中[3]，許多細胞因子因為結構上有共同的γ受體鏈，如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21等，具有不少近似的功能，同時它們也有各自的特點[4-5]。目前已有臨床試驗表明，γ 鏈細胞因子中的IL-2、IL-7及IL-21在增強抗病毒作用和促進免疫重建方面有積極效果[6-8]。然而，目前針對γ鏈細胞因子與HIV感染關聯性的報告尚不多見。

IL-2是分子級別第1個被發現，且最早被用于AIDS患者輔助治療的常見γ 鏈細胞因子，在抗各種感染包括HIV感染的免疫反應中都起到了重要的調節作用[4-5]。研究發現[9-10]IL-2和抗HIV免疫應答存在某些必然關聯。但是，由于IL-2對先天免疫和獲得免疫反應均有刺激效應，高劑量使用時可引發突出的毒性反應[11-12]。某些患者單一使用HAART無法獲得明顯免疫反應，聯用IL-2后出現輔助的臨床作用[13]，但也存在部分臨床觀察未發現IL-2對HAART的強化效果[14-15]。

IL-21是新近發現的細胞因子，主要由CD3+、CD4+細胞產生，在T細胞抗病毒感染應答過程中起重大的作用，對慢性病毒感染控制發揮免疫增強效應。數據表明，未經臨床干預的HIV/AIDS血漿IL-21水平低于正常人，并且與CD3+、CD4+細胞計數呈正相關。當前研究發現，IL-21通過對CD4+、CD8+細胞和自然殺傷細胞的調節，發揮控制病毒感染的功能[16];急慢性HIV感染者在未經干預前均可被檢測到因HIV特異而釋放IL-21的CD4+細胞，而這些細胞頻率的高低影響相關的病毒控制程度，且可以干預CD8+細胞的維持來促進對病毒的控制[17-18]。因此，在促進HIV感染者的NK細胞反應和控制病毒復制層面，IL-21可能有積極的輔助治療意義[19]。

IL-4大多由CD4+Th2細胞釋放，常見生物學作用是：刺激T細胞的增殖、分化，抑制Th1細胞的增殖與應答，通過自分泌途徑激發Th2細胞亞群的擴增，以及抑制巨噬細胞的功能。本研究發現HIV/AIDS患者的IL-4水平高于正常人，反映其與HIV感染機制存在可能關系。

IL-15由多種細胞產生，生物學效能與 IL-2相仿。在此次研究中觀察到HIV/AIDS患者的IL-15 水平明顯低于正常人，提示HIV感染的免疫受損過程中可能有其參與。目前研究發現，對IL-15含量下降的HIV/AIDS補充外源性IL-15可以明顯增強其免疫細胞的功能。國外報告表明，IL-15及其受體可作為DNA疫苗中產生和保持記憶CD8+細胞的有效方式，進而對CD8+細胞親和性成熟機制加以解釋，有望幫助新型疫苗的研制[20-21]。

綜上所述，現有研究充分說明C細胞因子的重要意義：促進外周血T細胞的自身穩定、存活增殖和功能調節，參與各種抗感染免疫的反應過程，其中某些因子已用于臨床疾病的輔助免疫治療和疫苗佐劑研發。由于存在種族遺傳差異，不同國家人群的細胞免疫特征也不盡相同，HIV-1流行病毒株在各個地區也有一定區別，因此在中國范圍內研究血細胞因子在HIV/AIDS感染的發病機制和抗病毒免疫應答中所扮演的角色具有巨大的科學意義和臨床價值。本研究對未經抗病毒治療的HIV/AIDS患者外周血常見的4個細胞因子濃度進行了初步觀察，分析發現它們與主要的免疫重建指標CD3+、CD4+細胞數量及主要的病毒學指標血漿HIV RNA水平存在不同程度的相關性。隨著進一步的深入研究和臨床觀察有可能更清楚地了解HIV/AIDS的免疫發病機制，為艾滋病抗病毒治療的輔助手段拓展新思路，為探索新更精準的免疫干預途徑打下基礎。

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