山楂標準湯劑的HPLC特征圖譜研究

郝磊 孫福仁 高晗 李雪利 田方 李振江 李軍山

摘 要：為了進一步研究山楂配方顆粒的質量控制方法，以山楂標準湯劑為研究對象，采用高效液相色譜儀與GL science C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸為流動相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，應用特征圖譜技術以及中藥指紋圖譜相似度評價軟件提取山楂標準湯劑特征圖譜中的特征成分。研究表明，15批山楂標準湯劑中共確定了7個特征峰，分離度較好，且峰面積較大，易于識別，使用參照物標定了3個特征峰成分，各共有峰相對保留時間的RSD值小于2.5%。所建立的山楂標準湯劑HPLC特征圖譜方法可靠、穩定，為山楂配方顆粒質量控制提供了一定的參考。

關鍵詞：中藥化學;山楂標準湯劑;特征圖譜;綠原酸;金絲桃苷;異槲皮苷

中圖分類號：R284.1?文獻標志碼：A

doi： 10.7535/hbgykj.2019yx06009

文章編號：1008-1534（2019）06-0422-07

Abstract：In order to study the quality control method of Crataegi fructus formula granules， the standard decoction of Crata-egi fructus is taken as the research object，the GL science C18（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm） chromatograms column are used. Acetonitrile-0.4% phosphoric acid is mobile phase， the column temperature is 30 ℃， the flow rate is 1.0 mL/min， and the detection wavelength is 254 nm. The characteristic components in the characteristic of the standard decoction of?Crataegi fructus are extracted by using characteristic atlas technology and similarity evaluation software of traditional Chinese medicine fingerprint. The results show that there are 7 characteristic peaks in 15 batches of Crataegi fructus standard decoction. The separation degree is good， and the peak area is large and easy to identify. Three characteristic peaks are calibrated with reference substance. RSD value of relative retention time of each common peak is less than 2.5%. The established characteristic chromatographic method of Crataegi fructus standard decoction is reliable and stable， which provides a reference for the quality control of Crataegi fructus formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese material medica; the standard dection of Crataegi fructurs; feature chromatograms; chlorogenic acid; hypericin; isoquercetin

山楂為薔薇科植物山里紅Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果[1]。山楂中含有多種黃酮類成分，如牡荊素鼠李糖苷、槲皮素、金絲桃苷、槲皮素-3-O-β-D-6-乙酰基吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及槲皮素-3-O-β-D-6-乙酰基吡喃阿洛糖苷;還含有枸櫞酸、牡荊素、熊果酸、綠原酸等有機酸類[2-3]。山楂為常用中藥，臨床應用廣泛。現代藥理學研究表明，山楂具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血壓等功效，山楂中的總黃酮對動物心肌缺血具有治療作用，所含的有機酸具有促進消化等功效[4-5]。

已有研究表明，使用HPLC建立指紋圖譜方法可用于對不同植物來源山楂藥材的鑒別[6-7]。彭燦等[8]采用乙腈-冰乙酸緩沖溶液，對山楂中的有機酸類成分進行了指紋圖譜分析，建立的指紋圖譜方法符合相關要求;鄒錄惠等[9]利用固相萃取SPE技術，結合HPLC指紋圖譜方法，對山楂藥材中的總黃酮類成分進行分析，確定了10個共有峰成分，并指認了4個共有峰;李曉亮等[10]對不同產地的山楂葉進行了指紋圖譜分析，發現山西晉城山楂葉的色譜峰較多。目前，未見山楂標準湯劑特征圖譜的相關文獻。本文以由不同產地山楂飲片制備而成的標準湯劑為研究對象，通過建立特征圖譜方法，對不同產地的山楂標準湯劑進行分析，以期為山楂配方顆粒的質量控制提供參考。

1?主要儀器與試劑

1.1?儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津株式會社提供;GL science C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）;CP225D型電子分析天平，賽多利斯公司提供;KH3200E型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司提供;電加熱套，北京科偉永興儀器有限公司提供;真空旋轉蒸發儀，上海申科生物技術有限公司提供;LGJ-12壓蓋型真空冷凍干燥機，河南兄弟儀器設備有限公司提供;圓底燒瓶，量筒，燒杯。

1.2?試劑

綠原酸對照品，批號為110737-201516，購自中國藥品生物制品檢定所;金絲桃苷對照品，批號為111521-201005，購自中國藥品生物制品檢定所;異槲皮苷對照品，批號為111809-201105，購自中國藥品生物制品檢定所;磷酸，分析純，批號為20170309，天津市科密歐化學試劑有限公司提供;甲醇，色譜純，批號為20170313，天津市科密歐化學試劑有限公司提供;乙腈，色譜純，批號為20171213，天津市科密歐化學試劑有限公司提供;水為自制純化水。

1.3?15批山楂標準湯劑的制備

1.3.1?山楂飲片來源

15批山楂飲片采購于山西、河北、山東產地的市場，經企業質控中心檢驗，15批飲片均符合《中華人民共和國藥典》2015版“山楂”項下的相關要求[1]。詳見表1。

1.3.2?山楂標準湯劑制備方法

分別取15批山楂飲片約100.0 g，除去可見異物（石頭、塵土等），轉移至圓底燒瓶中，加入飲片量8倍的水，浸泡30 min。大火加熱至沸騰，改小火煎煮30 min，過0.074 mm濾網，將濾液快速冷卻。在藥渣中加入飲片量6倍的水，大火加熱至沸騰，改小火煎煮20 min，過0.074 mm濾網，將濾液快速冷卻。合并2次煎液。將提取液用旋轉蒸發儀于60 ℃濃縮，濃縮至生藥量與濃縮液體積比約為1∶3時為宜。將濃縮液使用冷凍干燥機干燥。

2?方法與結果

2.1?色譜條件

島津LC-20AT高效液相色譜儀，色譜柱為 GL science C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL，流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B）。梯度洗脫程序見表2。

2.2?對照品溶液的制備

取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷對照品，精密稱定4，4.5，2 mg，轉移至50 mL容量瓶中。加入50%（體積分數，下同）的甲醇制成每1 mL含80 μg的綠原酸溶液，加甲醇制成每1 mL含90 μg的金絲桃苷溶液，加甲醇制成每1 mL含40 μg的異槲皮苷溶液，作為對照品溶液。

2.3?供試品溶液的制備

取標準湯劑0.40 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。精密加入70%甲醇25 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，即得。

2.4?方法學考察

2.4.1?精密度考察

取山楂標準湯劑樣品（S9）0.40 g，按供試品溶液制備項下所述方法制備供試品溶液，依照“2.1”項所述色譜條件，連續進樣測定5次。將所得色譜圖導入2008版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，并以共有色譜峰5為參照，計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值。特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.27%，相對峰面積的RSD值為0.00%～2.35%，均小于5.00%。說明該儀器的精密度符合分析方法的要求，詳見表3和表4。

2.4.2?重復性考察

取山楂標準湯劑（S9）0.40 g，按供試品溶液制備所述方法，平行制備5個樣品溶液，依照“2.1”項所述色譜條件進行測定。將所得色譜圖導入2008版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，以共有色譜峰5為參照，計算各特征峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD值。特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.86%，相對峰面積的RSD值為0.00%～3.05%，均小于5.00%，說明該方法的重復性符合分析方法要求，詳見表5和表6。

2.4.3?穩定性考察

取山楂標準湯劑（S9）0.40 g，按供試品溶液制備所述方法，制備樣品溶液，依照“2.1”項所述色譜條件，對同一樣品溶液分別于0，2，4，6，8 h測定。將所得色譜圖導入2008版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，并以色譜峰5為參照，計算各特征峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值。特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.89%，相對峰面積的RSD值為0.00%～2.95%，均小于5.00%，說明樣品在8 h以內測定，穩定性符合分析方法的要求。詳見表7和表8。

2.5?15批山楂標準湯劑特征圖譜的測定

對15批山楂標準湯劑按照“2.1”項所述色譜條件進行樣品處理及測定，結果見圖1。通過對15批山楂標準湯劑特征圖譜進行分析，確定了7個特征峰。通過查閱相關文獻[8-9]，并與標準品保留時間及紫外最大吸收比對，指認了7個特征峰中的3個成分：5號峰為綠原酸，6號峰為金絲桃苷，7號峰為異槲皮苷。詳見圖2。

2.6?數據分析

采用《中藥色譜指紋圖譜和相似度評價系統》，選取時間窗寬度為0.1 min，以中位數生成對照色譜圖，經過多點校正后自動匹配，生成山楂標準湯劑HPLC特征圖譜對照圖譜。15批山楂標準湯劑7個特征峰中5號特征峰（綠原酸）峰面積穩定，分離度良好，故選其作為參比峰。各共有峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）分別見表9和表10。

各共有峰相對保留時間的RSD值小于2.5%，說明各產地山楂的化學成分差異較小;相對峰面積的RSD值較大，范圍為0.00%～44.38%，說明不同產地山楂標準湯劑所含化學成分的相對含量相差較大。

15批山楂標準湯劑中共有7個特征峰，分離度較好，且峰面積較大，易于識別。因此，以上述7個共有峰作為特征峰，以5號共有峰作為S峰，相對保留時間值±8%為控制范圍，規定值如下：0.27（峰1）、0.50（峰2）、0.55（峰3）、0.59（峰4）、1.00（峰S）、1.45（峰6）、1.47（峰7）。

3?討?論

3.1?色譜條件的考察

通過實驗分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸3個流動相體系[11]。結果表明，采用乙腈-0.4%磷酸時，特征圖譜中的主要色譜峰分離較好，基線波動小，因此，確定采用乙腈-0.4%磷酸作為流動相。

3.2?提取溶劑的比較

通過對50%，70%甲醇水與100%甲醇進行比較，發現以70%甲醇提取的樣品中色譜峰的個數較多，峰形較好，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。對比超聲與回流提取方式，兩種處理方式色譜峰的數量、峰面積差異較小，而超聲提取法簡便、快捷，因此選用超聲提取方法。

3.3?山楂標準湯劑成分考察

考察了山楂標準湯劑中所含的有機酸、黃酮兩類成分。有機酸以綠原酸為代表，黃酮類成分以金絲桃苷、異槲皮苷為代表。由于蘆丁成分在山楂標準湯劑中的含量較低，響應值較弱，故未檢測到該成分。而在相關文獻中，可從山楂飲片中檢測出蘆丁成分[9]，說明山楂標準湯劑與山楂飲片在成分種類方面有一定的差異。河北產地的山楂中，S5樣品中的3號特征峰相對峰面積低于15批樣品的平均相對峰面積值，而相同產地S4和S6樣品3號特征峰的相對峰面積高于15批樣品的平均相對峰面積值，說明產地因素對山楂標準湯劑中的特征峰相對峰面積有較大的影響。但7個特征峰為15批山楂標準湯劑樣品共有，說明產地因素對特征峰種類的影響較小。故只應以7個特征峰的相對保留時間為規定值，根據相對峰面積無法制定出合理的規定值范圍。

4?結?語

1）2015版《中華人民共和國藥典》中規定，山楂飲片含量測定時以枸櫞酸為指標，采用的是酸堿滴定法。通過查閱文獻可知，枸櫞酸極性較大，在反相色譜中的保留值較弱[12]，故將山楂標準湯劑特征圖譜初始梯度設置為φ（乙腈）∶φ（0.4%磷酸）=5∶95。但該成分在特征圖譜中仍無保留行為，存在于特征圖譜前5 min的色譜峰群中。而山楂標準湯劑中綠原酸有較好的保留行為，且含量適中，故選取綠原酸峰作為特征圖譜的參比峰，同時，標定山楂標準湯劑中的黃酮類成分[13]。

2）山楂標準湯劑是以不同產地的山楂飲片為原料，經提取、濃縮、干燥制備而成。通過HPLC特征圖譜分析[14-15]可知，3個主產地的15批山楂樣品的峰個數差異較小，7個特征峰均出現在15批樣品中，但峰面積差異較大，相對峰面積的RSD值為0.00%～44.38%。

3）本研究的特征圖譜中只對3個特征峰進行了指認，其余特征峰還需進一步應用質譜等儀器進行分析，這也是今后需要加以改進的方面。

參考文獻/References：

[1]國家藥典委員會：中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2]晏仁義，魏潔麟，楊濱.山楂化學成分研究[J].時珍國醫國藥，2013，24（5）：1066-1068.

YAN Renyi，WEI Jielin，YANG Bin.Chemical constituents of Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2013，24（5）：1066-1068.

[3]孫敬勇，楊書斌，謝鴻霞，等.山楂化學成分研究[J].中草藥，2002，33（6）：483-486.

SUN Jingyong，YANG Shubin，XIE Hongxia，et al.Studies on chemical constituents from fruit of Crataegus pinnatifida[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2002，33（6）：483-486.

[4]史逸達.山楂葉總黃酮藥理作用淺析[J].中國中醫藥咨訊，2012，4（1）：437.

[5]許洪波，唐志書，劉澳昕，等.山楂核化學成分與藥理活性研究進展[J].中成藥，2018，40（3）：674-680.

[6]湯樹良，楊濱，黃璐琪，等.山楂高效液相指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2004，10（4）：9-13.

TANG Shuliang，YANG Bin，HUANG Luqi，et al. Studies on HPLC fingerprint of Fructus Crataegus[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2004，10（4）：9-13.

[7]龍鳳，謝鎮山，高新開，等.山楂HPLC指紋圖譜研究[J].中國現代中藥，2016，18（12）：1598-1601.

LONG Feng，XIE Zhenshan，GAO Xinkai，et al.Study on HPLC fingerprint of Crataegus pinnatifida[J].Modern Chinese Medicine，2016，18（12）：1598-1601.

[8]彭燦，關世俠，林吉，等.山楂的HPLC指紋圖譜研究[J].安徽中醫學院學報，2009，28（6）：66-68.

PENG Can，GUAN Shixia，LIN Ji，et al.Study on fingerprint chromatography crude Hawthorn berry by HPLC[J].Journal of Anhui Traditional Chinese Medical College，2009，28（6）：66-68.

[9]鄒錄惠，邱莉，焦楊，等.SPE-HPLC-UV法測定山楂藥材特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2014，34（9）：1597-1600.

ZOU Luhui，QIU Li，JIAO Yang，et al. Study on the characteristic chromatogram of Hawthorn berries by SPE-HPLC-UV method[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2014，34（9）：1597-1600.

[10]李曉亮，牛海軍，葛德助，等.山楂葉HPLC指紋圖譜研究[J].廣州化工，2016，44（17）：127-129.

LI Xiaoliang，NIU Haijun，GE Dezhu，et al.Study on HPLC fingerprint of Crataegi Folium[J].Guangzhou Chemical Industry，2016，44（17）：127-129.

[11]胡玉珍，唐潔，熊蘇慧，等.不同產地山楂與野山楂果實UPLC指紋圖譜的建立及模式識別[J].中成藥，2018，40（4）：982-987.

[12]楊濱，李化，湯樹良，等.高效液相色譜法測定山楂中枸櫞酸的含量[J].中國中藥雜志，2004，39（9）：697-699.

YANG Bin，LI Hua，TANG Shuliang，et al. Determination of citric acid in Fructus Crataegi by HPLC[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2004，39（9）：697-699.

[13]孫蓓，錢鈞強.HPLC測定山楂中蘆丁的含量[J].中國中藥雜志，2007，32（23）：2573-2574.

[14]孫福仁，李軍山，馬浩，等.基于UPLC特征圖譜與主成分分析評價白芷配方顆粒質量研究[J].河北工業科技，2018，35（6）：454-458.

SUN Furen，LI Junshan，MA Hao，et al.Evaluation of the quality

of formula granule of Angelicae dahuricae based on UPLC and PCA[J].Hebei Journal of Industrial Science and Techno-logy，2018，35（6）：454-458.

[15]田方，孫福仁，張肖建，等.合歡皮標準湯劑的HPLC指紋圖譜研究[J].河北工業科技，2019，36（2）：128-134.

TIAN Fang，SUN Furen，ZHANG Xiaojian，et al.Study on HPLC fingerprint of Cortex Albizzia standard decoction[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2019，36（2）：128-134.