熊果酸對膠原誘導性關節炎大鼠關節炎癥相關因子mRNA表達的影響

鮮瑤瑤 周儉 曾光 王莘智 劉沙 徐豫湘

〔摘要〕 目的 研究熊果酸（ursolic acid，UA）對膠原誘導性關節炎（collageninduced arthritis， CIA）大鼠關節X線及關節炎癥相關因子mRNA表達的影響。方法 SD大鼠采取皮下注射牛Ⅱ型膠原加弗氏不完全佐劑法建立CIA模型，取造模成功后大鼠隨機分為CIA模型組、UA低劑量組、UA高劑量組、甲氨喋呤（methotrexate， MTX）組、UA+MTX組并予以對應干預。另取6只正常大鼠為對照的空白組。初次免疫30 d斷頸處死大鼠，關節行X線攝片，再取下大鼠炎癥關節組織勻漿，提取RNA，熒光定量PCR法檢測IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β的mRNA表達。結果 與CIA模型組相比，UA高劑量組、MTX組、UA+MTX組X線評分減低（P<0.05或P<0.01）;各治療組IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表達降低（P<0.01或P<0.05）;各治療組IL-10、TGF-β因子的mRNA表達增高（P<0.01或P<0.05）。結論 UA可明顯緩解CIA大鼠關節炎癥，改善關節X線評分，其機制可能與調節炎癥因子的產生，維持組織促炎因子與抑炎因子的平衡有關。

〔關鍵詞〕 熊果酸;類風濕關節炎;膠原誘導性關節炎;X線評分;炎癥因子

〔中圖分類號〕R285.5;R593.22? ? ? ? 〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of ursolic acid （UA） on the articular X-ray and mRNA expressions of joint inflammation-related factors in collagen-induced arthritis （CIA） rats. Methods SD rats were given subcutaneous injection of bovine type II collagen plus Freund's incomplete adjuvant for modeling. After successful modeling， the rats were randomly divided into a CIA model group， a UA low-dose group， a UA high-dose group， a methotrexate （MTX） group and a UA + MTX group and they were given corresponding intervention. Another 6 normal rats were selected as the control group. Rats were sacrificed by neck breaking after 30 d of primary immunization， and the joints were taken X-ray. The tissue homogenate of rat's inflammatory joint was removed and RNA was extracted. The expressions of IL-17A， IL-10， IL-6， TNF-α， IL-1β， TGF-β and mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR. Results Compared with the CIA model group， the X-ray scores of the UA high-dose group， the MTX group， and the UA + MTX group were decreased （P<0.05 or P<0.01）; the mRNA expressions of IL-17A， IL-6， TNF-α and IL-1β in each treatment group were decreased （P<0.01 or P<0.05）; the mRNA expressions of IL-10 and TGF-β in each treatment group were increased （P<0.01 or P<0.05）. Conclusion UA can significantly alleviate joint inflammation in CIA rats and improve the articular X-ray score. The mechanism may be related to regulating the production of inflammatory factors and maintaining the balance between tissue pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors.

〔Keywords〕 ursolic acid; rheumatoid arthritis; collagen-induced arthritis; X-ray score; inflammatory factor

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種以侵蝕性關節炎為主要臨床特征的慢性自身免疫性疾病，其基本病理改變為滑膜炎、血管翳形成，可侵犯關節軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關節軟骨、骨和關節囊破壞。隨著病程的進展，RA患者殘疾和功能受限發生率升高[1]，及早發現并進行干預治療，延緩患者病情進展以及減輕患者痛苦，具有重要意義。RA的西醫發病機制尚不明確，目前多采用非甾體類抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs， NSAIDs）聯合改善病情的抗風濕藥物（disease modifying anti-rheumatic drugs， DMARDs）治療，長期使用不良反應較多。從傳統中藥中尋找和開發高效、低毒的抗風濕新藥是臨床的迫切需求。

熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏蘇酸、烏索酸，主要存在女貞子、山楂、陸英、夏枯草、車前草、白花蛇舌草、連翹、苦丁茶、甘草、連翹等藥用植物中，在夾竹桃、連翹葉、枇杷葉和白花蛇舌草中UA的含量最高[2]。研究表明UA具有廣泛而溫和的抗炎[3]、抗病毒、抗變態反應、保護胃黏膜和免疫調節等藥理作用[4-5]，UA也顯示出抗抑郁、心臟保護、腎保護、神經保護、胃腸保護、平喘、抗激素、抗關節炎和抗誘變作用[3]。RA是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，膠原誘導性關節炎（collageninduced arthritis， CIA）是最經典應用最廣泛的RA模型復制方法[6]，本實驗通過大鼠CIA模型來研究UA對關節炎影響，現具體報道如下。

1 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 動物? SPF級健康SD大鼠，8周齡，雌性，體質量（120±10）g，購于斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2018-0005，實驗動物質量合格證號：11400700151972;飼養處及實驗基地：湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，正常飼養一周后實驗。

1.1.2? 試劑? 牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex，貨號：20021）;弗氏不完全佐劑（Sigma，批號：BJ-012-0392）;熊果酸標準品（質量分數98%），Delta標準品公司提供，貨號：110742，采用二甲基亞砜（DMSO，阿拉丁，貨號：D103283）溶解;甲氨喋呤（methotrexate， MTX）注射液（規格：5 mg/支，山西普德藥業有限公司，批號02180101）;RNA提取液trizol（Invitrogen，貨號：15596018）。引物：生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR Mix試劑盒（立陶宛Fermentas）。

1.1.3? 儀器? MF-150G型Digital Diagnose X線片攝片機（美國BENNETT公司）;7500PCR儀（美國ABI）;T10 basic勻漿機（德國IKA）。

1.2? 方法

1.2.1? 造模與評估? 取70只雌性SD大鼠，隨機取6只作為正常對照組（空白組），其余大鼠均復制CIA模型[7]，將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原（濃度為2 mg/mL）與弗氏不完全佐劑（IFA）等體積混合，充分乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑（1 mg/mL）。在無菌條件下，于大鼠尾根部皮下注射（0.2 mL/只）配制好的Ⅱ型膠原乳劑，初次免疫當天作為0 d，第7天按上述方法、相同劑量（0.2 mL/只）加強1次。空白組注射等體積的生理鹽水。用關節炎指數作為判斷模型是否成功的標準。肢體關節腫脹按0-Ⅳ級評分：0，無紅腫;Ⅰ，趾關節稍腫;Ⅱ，趾關節及足趾關節腫脹;Ⅲ，踝關節以下足爪腫脹;Ⅳ，包括踝關節在內的全部足爪腫脹。AI值=四肢肢體關節腫脹級評分之和（Ⅰ級為1分，總分為16分）。AI≥4分為造模成功，本次成功率70%（于初次免疫12 d時造模成功）。

1.2.2? 分組與干預? 將造模成功的CIA大鼠隨機分為CIA模型組、UA低劑量組、UA高劑量組、MTX組、UA+MTX組，每組各6只。在初次免疫12 d時，UA低劑量組給予每天50 mg/kg灌胃，UA高劑量組給予每天100 mg/kg灌胃，MTX組每3天給予1 mg/kg灌胃，UA+MTX組予以每天UA 50 mg/kg、每3天予以MTX 1 mg/kg灌胃，空白組和CIA模型組大鼠分別給予等體積生理鹽水灌胃。每天觀察大鼠進食、大小便、精神狀態及一般活動情況。于初次免疫30 d斷頸處死大鼠，四肢行X線攝片，再取下大鼠炎癥的后足進行研究。

1.3? 觀察指標

1.3.1? 關節炎X線評分[8]? X線評分從軟組織腫脹、骨侵蝕和關節間隙改變3個方面綜合進行評價。初次免疫30 d時將各組大鼠的四肢關節置X線成像系統下攝片（湖南中醫藥大學附屬第一醫院放射科）進行X線評分計分。

1.3.2? 大鼠關節軟組織中炎癥相關分子IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β因子的mRNA表達檢測? 于初次免疫30 d，取大鼠炎癥的后足，組織勻漿，按說明書提取各組RNA。使用Nanodrop2000檢測RNA濃度及純度，將濃度過高的RNA進行適當比例的稀釋，使其終濃度為500 ng/μL。按照RT-RCR試劑盒說明書將RNA反轉錄合成cDNA，各引物序列見表1。取上述反應產物2.0 μLcDNA。配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管：2×qPCR Mix

12.5 μL;上游引物2.0 μL;下游2.5 μL;ddH2O8.0 μL。

反應條件：預變性：95 ℃10 min;循環（40次）95 ℃15 s→60 ℃60 s;熔解曲線，65 ℃→95 ℃，每15秒升溫0.3 ℃。在美國ABI7500熒光定量擴增儀上完成熒光實時監測PCR擴增，作出溶解曲線，收集熒光得到的曲線圖，用實時熒光定量PCR分析程序分析。ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內標基因，待測樣本），B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內標基因，對照樣本），K=A-B（mean），表達水平以2-ΔΔCT表示。

1.4? 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學分析軟件進行數據處理，計量資料采用“x±s”表示，行方差齊性檢驗，組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? UA 對CIA 大鼠的關節X線評分的影響

CIA模型組大鼠出現骨質疏松，足趾各關節空隙狹窄且模糊關節變形，關節X線評分增高。與空白組相比，CIA模型組大鼠關節X線評分明顯增高（P<0.01）。與CIA模型組相比，UA高劑量組X線評分降低（P<0.05），MTX組、UA+MTX組大鼠關節X線評分明顯降低（P<0.01）。與MTX組相比，UA低劑量組大鼠關節X線評分較高（P<0.05），見圖1-2。

2.2? UA對CIA大鼠關節軟組織炎癥相關分子IL-17A、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β因子的mRNA表達影響

與空白組相比，CIA模型組IL-6表達較高（P<0.05），IL-17A、TNF-α、IL-1β表達明顯增高（P<0.01），抑炎因子TGF-β、IL-10表達明顯降低（P<0.01）。與CIA模型組相比，UA低劑量組IL-17A、TNF-α、IL-1β降低（P<0.05）;UA高劑量組IL-6、IL-17A、TNF-α、IL-1β降低（P<0.05），抑炎因子TGF-β、IL-10表達升高（P<0.05）;MTX組IL-6、IL-1β表達降低（P<0.05），IL-17A、TNF-α表達明顯降低（P<0.01），抑炎因子TGF-β升高（P<0.05）、IL-10明顯升高（P<0.01）;UA+MTX組IL-6表達降低（P<0.05），IL-17A、TNF-α、IL-1β表達明顯降低（P<0.01），IL-10表達升高（P<0.05），TGF-β明顯升高（P<0.01）。與MTX相比，UA+MTX組TGF-β1表達升高（P<0.05），UA低劑量組IL-17A明顯增高（P<0.01）。見表2。

3 討論

RA臨床表現為關節腫脹、疼痛、變形，滑膜持續炎癥致骨骼破壞及軟骨降解為特征[9]，炎癥細胞因子激活破骨細胞是局部骨破壞的重要原因之一[10]。目前RA的致病原因尚未十分明確，故而無法采取針對性的根治措施。臨床治療的主要目標是緩解關節癥狀，控制病情進展，防止關節殘疾的發生，從而改善生活質量，但無法做到根除。CIA模型能顯示RA的慢性病變特征如關節滑膜增生、軟骨和骨破壞，關節功能障礙，是研究人類RA的理想模型。課題組前期研究發現，UA能明顯抑制體外T細胞激活與增殖[11]，降低Th17，升高Treg，維持Th17/Treg平衡[12-13]，UA體內給藥100 mg/kg一周，明顯減輕CIA大鼠關節的病理改變，減少大鼠關節中TNF-a、IL-17和PGE2的表達[14]。UA能明顯抑制CIA大鼠關節腫脹程度，抑制關節滑膜組織增生，減輕關節的病理改變，改善骨質破壞[15]。

基于UA的抗炎、抗腫瘤、免疫調節等多種生物學活性。推測UA能夠調節RA的免疫性炎癥。本文復制CIA模型，研究UA對實驗性RA大鼠關節炎癥相關因子及關節X線評分影響，發現UA（100 mg/kg·d）給藥能降低CIA關節X線綜合評分，減少炎癥因子IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-1β因子的mRNA表達，升高抑炎因子IL-10、TGF-β因子的mRNA表達。MTX是目前治療RA的基礎性藥物，其作用是抑制二氫葉酸還原酶以及甲酰基轉移酶的活性，具有免疫抑制以及迅速的抗炎作用[16]。以MTX為基礎的多種抗風濕藥物的聯合使用是臨床研究的主要方向。UA來源廣范，生物活性多，本實驗研究表明UA可以改善CIA大鼠關節腫脹程度，緩解CIA大鼠關節炎癥損傷，調節炎癥因子在關節組織中的表達及改善關節X線評分，具有炎癥的作用，作為一種有潛力的高效、低毒的中藥炎癥調節劑值得深入研究。

參考文獻

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