加減茵陳蒿湯聯合布地奈德對哮喘大鼠氣道反應性及肺組織中炎性細胞因子表達的影響

張鵬 楊冬妹 聶波 桑勉

摘要 目的：研究加減茵陳蒿湯聯合布地奈德對哮喘大鼠氣道反應性及肺組織中炎性反應細胞因子表達的影響。方法：選擇雄性SD大鼠作為實驗動物，分為對照組、模型組、觀察組，制作哮喘模型后給予加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療。測定氣道阻力、肺泡灌洗液（BALF）中炎性細胞的數目以及肺組織中炎性細胞因子的表達水平。結果：模型組大鼠注射乙酰甲膽堿（MCh）后的氣道阻力及BALF中中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的數目及肺組織中白細胞介素（IL）-2、IL-6、干擾素-γ（IFN-γ）、嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin）、CCL19、CCL21的mRNA表達水平均明顯高于對照組（P<0.05）;觀察組大鼠注射MCh后的氣道阻力及BALF中中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的數目及肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、eotaxin、CCL19、CCL21的mRNA表達水平均明顯低于模型組（P<0.05）。結論：加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療哮喘大鼠能夠降低氣道反應性、抑制肺組織中的炎性反應，在哮喘治療中展現出積極價值。

關鍵詞 支氣管哮喘;茵陳蒿湯;氣道反應性;炎性反應;哮喘;大鼠;實驗

Abstract Objective：To study the effects of modified Yinchenhao Decoction combined with budesonide on airway responsiveness and expression of inflammatory cytokines in lung tissue of asthmatic mice.Methods：Male SD rats were divided into a control group，a model group and a treatment group.After making asthma model，the mice were treated with modified Yinchenhao Decoction combined with budesonide.The airway resistance，the number of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）and the expression of inflammatory cytokines in lung tissue were measured.Results：The airway resistance，the number of neutrophils，eosinophils and lymphocytes in BALF and the expression of interleukin-2（IL-2），IL-6，interferon-γ（IFN-γ），eotaxin，CCL19 and CCL21 in lung tissue of model group mice were significantly higher than those of control group（P<0.05）.The airway resistance after MCh injection and the number of neutrophils，eosinophils and lymphocytes in BALF and the expression of IL-2，IL-6，IFN-γ，eotaxin，CCL19 and CCL21 in lung tissue of treatment group were significantly lower than those of the model group（P<0.05）.Conclusion：Modified Yinchenhao Decoction combined with budesonide can reduce airway reactivity and inhibit inflammation in lung tissue of asthmatic mice，which shows positive value in the treatment of asthma.

Key Words Bronchial asthma; Yinchenhao decoction; Airway reactivity; Inflammation reaction; Asthma; Rats; Experiment

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.06.010

支氣管哮喘是臨床上常見的呼吸系統疾病，以氣道慢性炎性反應、氣道高反應性為基本病理特征，臨床上表現為反復發作的喘息、氣促等。布地奈德是糖皮質激素類藥物，被廣泛用于哮喘治療，通過抑制氣道炎性反應、舒張氣道平滑肌來發揮治療作用，但仍有部分患者的哮喘反復發作，給患者及家庭帶來較大負擔[1-2]。近年來，中醫藥物在呼吸道疾病治療中的價值受到了越來越多的關注，根據中醫理論，哮喘屬于“咳嗽”“哮病”“喘證”的范疇，其主要病機在“脾腎氣虛、痰濁內生、伏于肺臟”[3-4]。茵陳蒿湯是具有清熱、利氣、祛痰作用的中藥湯劑，根據哮喘的中醫病機進行加減，加用苦參、浙貝母、石葦，車前草、瓜蔞能夠增強該方劑清熱利濕、化痰平喘的作用。為了明確加減茵陳蒿湯用于哮喘治療的價值，本研究具體分析了加減茵陳蒿湯聯合布地奈德對哮喘大鼠氣道反應性及肺組織中炎性反應細胞因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選擇健康的雄性SD大鼠作為實驗動物，體質量150～180 g。由本醫院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（京）2015-0001。實驗室常規條件飼養、20～25 ℃、自由攝食飲水。

1.1.2 藥物 布地奈德混懸液（阿斯利康公司，批號：H20140475）;加減茵陳蒿湯由醫院藥劑科制備，包括茵陳12 g、梔子6 g、苦參9 g、浙貝母9 g、甘草9 g、瓜蔞9 g、秦艽9 g、石葦9 g、車前草9 g，濃縮得到含有1 g/mL生藥的藥液。

1.1.3 儀器與試劑 卵清蛋白（OVA）（批號：9006-59-1）、乙酰甲膽堿（MCh）（批號：62-51-1）及氫氧化鋁（批號：1330-44-5）購自Sigma公司;細胞因子表達檢測試劑盒購自北京康為世紀公司，具體為UltraSYBR Mixture試劑（批號CW2601S）、超純RNA提取試劑盒（批號CW0597）、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒（批號CW0741）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實驗大鼠分為對照組、模型組和觀察組。模型組和觀察組按照下列方法建立哮喘模型：第1天、第14天時給予含有0.1 g OVA和1 mg氫氧化鋁的0.2 mL混懸液;第21天開始，將大鼠放置在密閉容器中并給予5 mL 2% OVA溶液霧化吸入以激發哮喘，1次/d、30 min/次，共激活14次。

1.2.2 給藥方法 首次激發哮喘的當天，觀察組開始給予10 mL/kg的藥液灌胃，1次/d，同時在OVA霧化激發哮喘前給予1 mg布地奈德溶于5 mL生理鹽水、霧化吸入;對照組和模型組給予10 mL/kg的生理鹽水灌胃1次/d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 氣道反應性測定 末次激發哮喘后24 h，給予50 mg/kg的1.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定在實驗臺并安裝小動物呼吸機，按照間隔4 min的頻率依次腹腔注射3.125 mg/kg、6.25 mg/kg、9.375 mg/kg、12.5 mg/kg的MCh，注射MCh后記錄氣道阻力。

1.2.3.2 肺泡灌洗液（BALF）中細胞的測定 完成氣道反應性測定后，打開胸腔、解剖右側肺，將0.9 mL生理鹽水注入支氣管并反復抽吸，得到BALF后以12 000 r/min的速度離心15 min，取細胞沉淀并用1 mL磷酸鹽緩沖液重懸，用瑞氏染色法染色后在油鏡下觀察中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞并細胞數目。

1.2.3.3 肺組織中細胞因子的測定 完成BALF的取材后，解剖灌洗后的右側肺組織，采用試劑盒提取組織中的RNA，將RNA反轉錄合成為cDNA并進行PCR反應，所用引物分別為白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin）、CCL19、CCL21的特異性引物，根據PCR反應曲線計算基因的mRNA表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，3組間計量資料用均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠氣道阻力水平比較 注射不同劑量的MCh后，與對照組比較，模型組大鼠的氣道阻力水平明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組大鼠的氣道阻力水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 BALF中炎性反應細胞的數目 與對照組比較，模型組大鼠BALF中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的數目明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組大鼠BALF中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的數目明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 肺組織中促炎細胞因子的表達量 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ的mRNA表達量水平明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組大鼠肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ的mRNA表達量水平明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 肺組織中趨化細胞因子的表達量 與對照組比較，模型組大鼠肺組織中eotaxin、CCL19、CCL21的mRNA表達量水平明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，觀察組大鼠肺組織中eotaxin、CCL19、CCL21的mRNA表達量水平明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

哮喘屬于中醫“咳嗽”“哮病”“喘證”的范疇，西醫則認為哮喘的特征為慢性氣道炎性反應所介導的氣道高反應性。根據《證治匯補》中記載，“哮即痰喘之久而常發者，因內有壅塞之氣、外有非時之感、膈有膠固之痰，三者相合，閉拒氣道、搏擊有聲，發為哮病”[5-6]。“痰”在“哮病”的發生中起到關鍵作用，痰的產生與體內脾腎功能失常、水液代謝紊亂有關，脾腎氣虛、痰濁內生、伏于肺臟是“哮病”“喘證”發病的主要病機[7-8]。西醫治療哮喘的主要手段是抑制氣道炎性反應、促進氣道平滑肌舒張，布地奈德是臨床上廣泛應用的哮喘治療藥物，屬于糖皮質激素，具有強大的抗炎活性，對抑制哮喘發作具有良好的效果[9-10]。中醫治療哮喘的重要手段是針對脾腎氣虛、痰濁內生、伏于肺臟的病機選用化痰理氣的藥物，近年來也有越來越多的中藥湯劑被用于哮喘的治療[11-12]。

本研究所采用的加減茵陳蒿湯作為治療哮喘的中藥湯劑，方中茵陳清熱利濕為主藥，梔子清利三焦之火為臣，加用苦參、秦艽以增清熱祛濕之功，石菖蒲、郁金化濕濁、醒脾，石韋、車前草清熱利小便，濕性重濁趨下，虞摶在《醫學正傳》中指出：“治濕不利小便，非其治也”。另加浙貝母、瓜蔞清熱化痰，通腑泄熱，肺氣得降。甘草調和諸藥，緩和藥性。諸藥共奏清熱利濕宣痹、祛除發病之源、延緩病情進展之功效。原方中茵陳蒿、梔子、大黃三味中藥材具有清熱、利氣、祛痰的作用。在原方的基礎上加用苦參、浙貝母、甘草，苦參起到泄腸腑之熱的作用，浙貝母起到清熱降氣化痰的作用，甘草則起到調和諸味藥物、緩解苦藥苦寒之性的作用。全方組合共奏祛痰、利氣、清熱之功。為了明確加減茵陳蒿湯用于哮喘治療的價值，本研究首先通過腹腔注射OVA的方式進行致敏、霧化吸入OVA激發哮喘，在注射MAh激活氣道平滑肌膽堿能受體、促進平滑肌收縮后觀察氣道阻力：模型組S的氣道阻力水平明顯高于對照組，提示哮喘動物模型出現了氣道阻力升高的氣道高反應性癥狀。在建立哮喘模型后采用加減茵陳蒿湯進行灌胃治療，觀察結果顯示：觀察組大鼠的氣道阻力水平明顯低于對照組，表明加減茵陳蒿湯治療能夠降低哮喘大鼠的氣道阻力、在哮喘治療中展現出積極價值。

氣道的慢性炎性反應是造成哮喘病程中氣道反應性升高的基本病理環節，氣道平滑肌內大量炎性反應細胞浸潤[13-14]。本研究通過分析BALF中中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎性反應細胞的數目來反應氣道平滑肌內炎性反應細胞的浸潤，結果顯示：模型組大鼠BALF中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的數目明顯高于對照組，加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療后BALF中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞的數目明顯低于模型組，提示加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療能夠抑制哮喘大鼠氣道平滑肌內多種炎性反應細胞的浸潤，進而有利于減輕氣道炎性反應。炎性反應細胞在氣道內的進入與多種炎性反應細胞因子的促炎活性及趨化活性有關，IL-2、IL-6、IFN-γ是與哮喘發生密切相關的促炎因子[15-17]，eotaxin、CCL19、CCL21是與哮喘發生密切相關的趨化因子[18-20]，本研究對肺組織中細胞因子的分析顯示：模型組大鼠肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、eotaxin、CCL19、CCL21的表達水平明顯高于對照組，加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療后肺組織中IL-2、IL-6、IFN-γ、eotaxin、CCL19、CCL21的表達水平明顯低于模型組。這一結果表明加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療能夠減少哮喘大鼠肺組織中多種炎性反應細胞因子的表達，由此更進一步證實加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療能夠抑制哮喘的炎性反應。

綜上所述，加減茵陳蒿湯聯合布地奈德治療哮喘大鼠能夠降低氣道反應性、抑制肺組織中的炎性反應，今后可進一步在臨床中使用加減茵陳蒿湯來治療哮喘并進一步驗證加減茵陳蒿湯在哮喘治療中的積極價值。

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（2019-01-23收稿 責任編輯：王明）