廣西部分地區野生茶樹遺傳關系EST-SSR標記分析

黃壽輝 溫立香 彭靜茹 張芬

摘 要：為了明確廣西野生茶樹種質資源的遺傳背景，該研究從廣西的寧明縣、金秀縣、蒼梧縣收集到14份地方野生茶樹種質資源，以17個國家級茶樹良種作為參照，采用EST-SSR分子標記技術，探討了廣西這三個地方野生茶樹與國家級茶樹良種間的親緣關系以及廣西地方茶樹自身的遺傳多樣性。結果表明：15對EST-SSR引物共檢測到68個等位基因，平均每個引物可擴增出4.53個，其中多態性位點為60個，多態性比率達88.2%。平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均Shannon信息指數分別為0.42、0.55和0.97。PIC值在0.23～0.74之間，平均為0.52，多態性較好。遺傳相似系數在0.53～0.9之間，平均值為0.71，31份供試材料在遺傳相似系數為0.71分為5組群，76%參照品種聚在A組群，而廣西本地的野生茶樹資源則主要分布在B、C、D、E組群。利用該研究中的4對核心引物即可將31份供試材料全部區分開，挑選其中10個多態性較好的等位位點進行編碼，構建31份供試種質的DNA分子指紋圖譜。這表明廣西野生茶樹資源與國家級茶樹良種間遺傳差異較大、親緣關系較遠、遺傳基礎寬、多樣性非常豐富，可作為茶樹育種的親本或開展茶樹功能基因研究的材料。

關鍵詞：野生茶樹， 種質資源， EST-SSR， 遺傳多樣性， DNA分子指紋圖譜， 廣西

中圖分類號：Q941， S571.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）06-0821-10

Abstract：In order to clarify the genetic background of wild tea tree germplasm resources in Guangxi， fourteen local wild tea tree germplasm resources were collected from Ningming County， Jinxiu County and Cangwu County， Guangxi. Taking seventeen state-level tea cultivars as reference， and adopting EST-SSR molecular marker technology， the research focused on the genetic relationship between these wild tea trees and the state-level tea cultivars in three places of Guangxi and the genetic diversity of local tea trees in Guangxi. The experiment results showed that a total of 68 alleles were detected in fifteen pairs of SSR primers， and each primer could amplify 4.53 by average， of which polymorphic site were 60， and the polymorphic ratio was 88.2%. The average observed heterozygosity， average expected heterozygosity， and average Shannon information index were 0.42， 0.55， and 0.97 respectively. The PIC value was between 0.23-0.74 with an average of 0.52， and the polymorphism was good. The genetic similarity coefficient was between 0.53 and 0.9， with an average value of 0.71. The test materials were divided into five groups at genetic similarity coefficient of 0.71， among which 76% reference warietics were clustered in Group A， while the local wild tea tree resources in Guangxi were mainly distributed in B， C， D and E groups. By using the four pairs of core primers in this study， 31 test materials could be completely distinguished. Ten allelic sites with good polymorphisms were selected for coding， and 31 DNA fingerprints of the tested germplasm were constructed. The study indicates that there is a great genetic difference between the wild tea trees in Guangxi and the state-level tea cultivars. The wild tea tree resources in Guangxi has distant genetic relationship， wide genetic basis and rich diversity， and can be used as the parent for tea tree breeding or materials for studying tea tree functional genes.

Key words：wild tea tree， germplasm resources， EST-SSR， genetic diversity， DNA molecular fingerprint， Guangxi

茶樹種質資源是開展茶樹種質創新、新品種選育、功能基因挖掘等研究的的物質基礎和基本條件，種質資源豐富與否與新品種選育成功率有著緊密的聯系（周萌等，2013）。研究表明，茶樹起源于我國云南、四川、貴州交界地區（虞富蓮，1986），而廣西與貴州、云南、四川接壤，是茶樹次生起源地（覃秀菊等，2006），常年水熱資源豐富，自然條件優越，孕育著豐富的野生、半野生茶樹種質資源。經過長期自然選擇和自身進化，廣西各地野生茶樹資源在表型、農藝性狀、內含物含量上具有豐富的差異性（覃秀菊等，2006;彭靖茹等，2019）。但對于廣西野生茶樹種質資源的研究多數僅限于調查、收集和簡單分布地理位置和形態的描述，對于其遺傳特性的研究鮮見報道。

用于茶樹種質資源遺傳分析與評價的方法主要有形態學標記法、生化標記法和DNA分子標記法三種，由于形態學標記法過多依賴鑒定者的經驗，且鑒定結果易受生產方式和環境影響（劉本英，2009），故其鑒定的可靠程度不高。生化標記法由于受限于蛋白質種類偏少，因此其檢測位點較少，多態性不夠豐富，不能有效區分親緣關系非常密切的茶樹資源（喬婷婷，2010）。DNA分子標記直接反映基因組DNA水平遺傳變異，多態性豐富、準確性高、重復性好，且不隨發育時期而變化，不受環境影響，鑒于此，DNA分了標記技術已被廣泛應用在包括茶樹在內的各類作物種質資源遺傳分析和鑒定上（姚明哲，2009）。目前，應用于茶樹遺傳分析的分子標記主要有RAPD、AFLP、ISSR和EST-SSR標記（王麗鴛等，2004;姚明哲和陳亮，2003;粱慧玲和梁月榮，2003），其中EST-SSR相對其他標記具有等位點多、共顯性、重復性好、多態性高、數量豐富等優勢（Powell et al.， 1996），且可直接從EST數據庫中篩選獲得SSR，開發成本相對較低（Varshney et al.， 2005），另外EST-SSR序列為基因組的表達序列，其差異性直接反映出基因表達的差異（Saha et al.， 2005; Gao et al.， 2004）。EST-SSR應用于茶樹遺傳分析屢見報道：如金基強等（2007）首次基于EST-SSR引物對浙江、福建等地的優良茶樹品種資源進行了分析，結果充分說明EST-SSR標記可有效分析茶樹種質資源，能真實反映不同品種間的遺傳差異;劉振等（2008）利用EST-SSR標記對60份中國西南茶區的茶樹資源進行了遺傳多樣性和親緣關系分析，研究結果表明EST-SSR標記非常適用于茶樹遺傳多樣性和親緣關系的研究，同時結果也顯示我國西南茶區的茶樹種質資源多樣性非常豐富，值得深入開發研究。姚明哲等（2009）通過EST-SSR標記對45份江北茶區的茶樹初級核心種質的遺傳多樣性和遺傳結構分析，提出可進一步對初級核心種質進行篩選，選擇更有遺傳代表性的資源，構建江北茶區的核心種質，從而提高江北茶區優異資源發掘和利用的效率。陳熙等（2016）基于EST-SSR分子標記對陜西茶樹資源遺傳多樣性進行分析，指出陜西茶樹種質資源遺傳多樣性處于較高水平，從群體種選育良種是可行的。

利用DNA分子標記技術開展廣西野生茶樹資源的遺傳多樣性和親緣關系分析，可充分認識廣西野生茶樹種質資源的遺傳特性，對廣西茶樹資源的分子鑒定、品種遺傳改良、種質保護、核心種質的構建、重要農藝性狀基因定位以及分子標記輔助育種都具有重要的參考價值和理論指導意義。該研究利用EST-SSR技術對廣西部分野生茶樹資源進行遺傳特性研究，旨在揭示廣西野生茶樹種質資源的遺傳基礎，為今后核心種質資源收集利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的31份茶樹種質資源（表1），14份取自分布在廣西金秀、寧明、六堡鎮的野生茶，另外17份為國家級優良品種。于2018年春季采摘一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍，然后置于-70 ℃冰箱中保存備用。

1.2 DNA提取

采用改進的CTAB法（陳盛相，2009）提取茶葉DNA，使用分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量和濃度。然后稀釋DNA原液至50 ng·μL-1，于-20 ℃保存備用。

1.3 EST-SSR標記

參照姚明哲（2009）報道的EST-SSR標記，經過材料篩選，選出15對多態性高、帶型清晰的引物，引物信息如表2所示，委托華大基因科技有限公司合成。

1.4 PCR擴增及產物檢測

按（表3）配制EST-SSR反應體系，進行PCR擴增。PCR擴增各個循環參數：先94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，對應溫度退火30 s（各引物退火溫度見表2），72 ℃延伸2 min，35個循環;然后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。參照黃壽輝（2013）方法進行PCR產物聚丙烯酰胺凝膠檢測、銀染顯色和拍照記錄。

1.5 數據統計與分析

每對SSR引物檢測一個位點，每條多態性條帶視為一個等位變異，采用人工讀帶方法，將電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計為“0”，建立“0-1”原始數據矩陣。使用軟件Popgene32（Yeh et al.， 1999）統計每個引物在31份材料中擴增的等位基因數（Na），觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He），Shannon信息指數（I）。根據公式PIC=1-∑（Pi）2計算每個引物的多態性信息量（PIC），其中Pi是帶有第i個等位基因群體的比例。根據公式DICE=2a/（2a+b+c）計算品種間的DICE遺傳相似性系數，其中a為品種i與品種j共有帶型數目，b為品種i特有帶型數目，c為品種j特有帶型數目。用NTSYS-pc2.1（Rohlf，2000）軟件進行品種間多態性和相似系數分析，通過非加權配對算術平均法（UPUMA）進行聚類分析，建立親緣關系樹狀圖。結合供試材料的形態學特征，對聚類分析結果進行分析討論。

2 結果與分析

2.1 EST-SSR擴增結果及多態性分析

利用15對EST-SSR引物對31份實驗材料進行多態性檢測，部分引物擴增結果見圖1。如表4所示，共檢測到68個等位位點。擴出等位位點數最多的引物為T395和T588，分別可以擴出6個等位位點，其次是T6、T8、T185、T685、T802、T1110，均可擴出5個，T12、T21、T228、T641、T687可擴出4個，T663、T113為3個，T13擴出的等位位點最少，為2個，平均每個引物可擴出的等位位點數為4.47個。在擴增到的68個等位基因中有14個特異等位基因，主要分布在寧明2號、寧明4號、六堡1號和金秀5號中，表明這幾個種質在某些位點與其他種質有著很大差異，是研究等位基因功能差異的良好材料。對于整個群體而言，群體的觀測雜合度（Ho）變化范圍為0.18（T113）～0.63（T1110），

平均為0.42;期望雜合度（He）的變化范圍為0.23（T113）～0.74（T588），平均為0.55。Shannon信息指數（I）變幅在0.35～1.53之間，平均0.97。多態性信息含量（PIC值）是衡量引物擴增位點多態性的重要指標。當PIC>0.5時，表明擴增位點具高度多態性，0.25<PIC<0.5時，為中度多態性，PIC<0.25時為低度多態性（Botstein et al.， 1980）。該研究選用的15個引物的PIC值在0.23～0.74之間，平均為0.52，標記T13（PIC=0.23）為低度多態位點，4個標記T687（PIC=0.43）、T663（PIC=0.28）、T21（PIC=0.21）、T641（PIC=0.26）為中度多態位點，其它10個為高度多態位點，PIC值變化范圍為0.51～0.74，表明所選用EST-SSR引物在茶樹上具有較高水平的擴增位點多態性，不同EST-SSR位點的多態性有明顯差異，同時也說明廣西野生茶樹與國家級茶樹良種間遺傳差異大，具有較高的遺傳多樣性。

2.2 31份供試種質的親緣關系

根據31份供試茶樹種質資源擴出的68個EST-SSR位點的譜帶數據組成原始矩陣，計算所有種質之間的遺傳相似性系數，繪制親緣關系聚類圖（圖2）。圖2結果表明，供試種質間的遺傳相似系數為0.53～0.90，平均為0.71，當遺傳相似系數等于0.82時，70%種質已經完全分開，其中金秀1號和金秀3號的遺傳相似系數最高，達到0.90，寧明2號與湘波綠最低，僅為0.38， 表明廣西野生茶樹種質資源間經長期的自然選擇后，與當前推廣的國家級良種間存在較大的遺傳差異，而廣西野生資源之間既表現一定的遺傳相似性，也存在著豐富的遺傳差異。從系統樹發現，31份供試材料分類比較零散，沒有很明顯的大群組，在相似系數為0.71左右分為5組群：A、B、C、D和E，其中A組群包含19份材料，占到所有供試的61%，分別是黃金芽、黃金葉、玉麒麟、六堡2號、梅占、金觀音、黃觀音、福鼎大毫、黃玫瑰、桂香18號、六堡3號、六堡4號、堯山秀麗、桂綠1號、云南大葉種、金秀1號、金秀3號、金秀5號;B組群有金秀2號、金秀4號、碧香早、湘波綠;C組群也有6個材料，分別是白玉1號、紫鵑、六堡1號、六堡5號、寧明1號、寧明3號;D和E組群分別都只有1份材料，分別是寧明4號和寧明2號。以相似系數0.78為閾值，A組群又可分為7個亞群，B組群細分為3個亞群，C組群則分為4個亞群。從整個親緣關系看，大部分資源按照相同地域來源聚在一起，如A3亞組群中來自浙江安吉的黃金葉和黃金芽，來自廣西桂林的A4亞組群桂綠1號和堯山秀麗，來自湖南長沙的B3亞組群碧香早和湘波綠，還有A6亞組群金秀1號和金秀3號，C3亞組群寧明1號和寧明3號，兩份材料彼此間的遺傳相關系數相對較小，說明較近的地理關系表現出較近的親緣關系;A1組群中，金牡丹、金觀音、黃觀音均由鐵觀音與黃金桂雜交而得，而黃玫瑰又是由黃金桂與黃觀音回交一個世代獲得，顯然他們之間的遺傳相似系數相對要高，聚到一起也是情理之中;另外C2亞組群中的紫鵑和六堡1號，兩者雖然不是來自同一地區，但兩份材料均為紫芽材料，也聚到了同一個分支上，較相近的形態學特征也表現出較近的親緣關系，說明該研究所選用的引物可對供試材料的遺傳差異性進行比較客觀科學的分析。

2.3 供試種質的DNA指紋圖譜

使用15對EST-SSR引物，其中的T8、T21、T588、T1110共4對引物即可鑒定供試的31份種質，基于這4對引物對每份茶樹資源的等位基因帶型，挑選其中10個位點進行組合編碼，構建了31份供試種質的DNA分子指紋圖譜（圖3），并獲得10位數DNA分子身份證編碼（表5）。表5結果表明每份材料都對應唯一的身份證編碼，這4對EST-SSR引物可作為鑒別茶樹品種參考引物。

3 討論與結論

3.1 EST-SSR標記的多態性豐富，能對供試材料的遺傳多樣性進行客觀分析隨著分子生物學、生物信息學、基因組學的快速發展，可供用于植物遺傳研究的分子標記種類越來越豐富，除了傳統的RAPD、AFLP、ISSR、EST-SSR，近年來又出現了STS、SNP等分子標記，但茶樹作為異花授粉的多倍體木本植物，基因組相對比較復雜，DNA分子標記在茶樹遺傳研究起步較晚，目前多數標記在茶樹上的研究基本處在初步階段。本研究用15對EST-SSR引物對14份廣西野生茶樹資源和17份國內優良茶樹品種進行了遺傳多樣性和親緣關系的分析。15對EST-SSR引物各項數據均處于理想的范圍，說明所篩選獲得的標記多態性較好。聚類圖中，相同來源、相同親本、相同形態特性的材料均聚到了一起，說明選用的引物能對材料的等位位點進行有效擴增，真實客觀反映出供試材料的遺傳多樣性。白玉1號、紫鵑和六堡1號表現出按葉色優先聚類的趨勢，說明葉色的多樣性是分子標記遺傳多樣性表現形式的一個方面，但這些EST-SSR標記是否與茶樹葉色相關聯還需要進一步研究。該研究中用四個引物即可將供試31種質全部分開，經過計算機處理，形成了每個種質唯一的分子身份證編碼，說明所用引物等位位點非常豐富，具有很強的茶樹品種鑒別能力，這套引物可用于構建茶樹品種分子指紋圖譜或作為茶樹品種鑒定的參考引物。

3.2 廣西野生茶樹資源遺傳多樣性豐富本研究在聚類結果中，大部分資源能夠按照相同的地理來源或相似的形態學特性聚在同一類群，但也有部分材料例外，體現了茶樹復雜的親緣關系。在親緣關系圖中，供試的17份國家級良種中有13份都聚在A組群，占到總數的76%;而廣西本地的野生茶樹資源則分布在B、C、D、E組群，說明廣西野生茶樹資源與國家級茶樹良種遺傳差異較大。另外，廣西本地的野生茶樹中，來自同一地區的材料間或者來自不同地區的材料間，除了金秀1號和金秀3號遺傳相似系數達到0.9外，其他兩兩之間的遺傳相似系數均小于0.81，寧明2號和寧明4號甚至在相似系數為0.53和0.64時便單獨聚成一類。可見，廣西野生茶樹資源的遺傳多樣性非常豐富。這主要得益于廣西作為茶樹亞起源中心，自北向南分為中亞熱帶、南亞熱帶、北熱帶3個氣候帶，多樣的氣候環境也就孕育了多樣性十分豐富的野生茶樹資源，又由于廣西多山地，阻隔了各茶區之間的基因自然交流，這就使各個茶區形成了一個個相對獨立的資源庫。

3.3 廣西野生茶樹種質資源遺傳多樣性的利用和保護廣西野生茶樹種質資源豐富，以往限于人力和技術，很多資源并未得到很好的挖掘，基于廣西本地茶樹資源選育出的茶樹良種少之又少，隨著人們對種質資源認識的不斷深入和研究分析手段的不斷豐富，廣西野生茶樹資源正逐步引起重視并被加以研究利用。利用分子標記技術對廣西野生茶樹資源進行遺傳多樣性分析，揭示育種材料之間的親緣關系。在農藝性狀優良的前提下，將親緣關系遠的材料進行雜交，可望獲得遺傳基礎豐富、變異類型多甚至超親的雜交后代。從本研究結果來看，材料寧明2號和寧明4號在遺傳相似系數分別等于0.53和0.63時單獨聚類，說明它們與其他供試材料間的遺傳差異較大，分別選擇寧明2號或者寧明4號與國家級良種進行雜交育種，如：金牡丹（寧明2號與金牡丹遺傳相似系數為0.57）、湘波綠（寧明2號與湘波綠遺傳相似系數為0.58）、碧香早（寧明2號與碧香早遺傳相似系數為0.55），都有望獲得具有優良性狀的雜交后代。可見，遺傳多樣性分析可以為親本配置提供依據，使所做的育種工作更加有針對性，提高優良品系選育的效率。遺傳多樣性分析在種質保護中同樣具有重要價值，在開展收集種質資源工作時，人們往往通過肉眼觀察，根據形態學特性、農藝性狀來篩選種質，但對于一些形態特性相似種質會難以做出選擇，從而會錯過一些攜帶優異基因的種質材料，另外僅從形態學往往會過高估計（Bushakra et al.，1999），收集到重復材料，在實際收集工作中造成人力、物力、財力的浪費。收集前先對野生材料進行系統的遺傳多樣性分析，然后根據分析結果篩選收集種質，從而以最少數量的遺傳資源最大限度地保存整個資源群體的遺傳多樣性，起到事半功倍的效果。

隨著茶樹基因組測序工作完成，茶樹分子標記數量和種類將有大幅度增加，結合廣西野生茶樹資源豐富的優勢，今后重點對我區野生茶樹資源的遺傳特性進行分析、鑒定，挖掘茶樹功能基因并進行QTL定位，開展茶樹遺傳圖譜繪制等，在為我區乃全國茶樹育種工作不斷提供新的種質材料的同時，可極大促進茶樹分子標記輔助育種的進一步發展。

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