白芷、吳茱萸、川芎對偏頭痛大鼠血清ENK、β-EP含量及腦干組織C-FOS表達(dá)的影響

吳輝 陳曉光 魏丹 蘇曼莉 姚漢云 劉慧 王淼

〔摘要〕 目的 觀察單味中藥白芷、吳茱萸、川芎對偏頭痛模型大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及腦干C-FOS表達(dá)的影響。方法 將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組（每組8只）：空白組、模型組、白芷治療組、吳茱萸治療組、川芎治療組、西比靈治療組（藥物對照）。各治療組分別按0.79 g/kg、0.40 g/kg、0.79 g/kg、0.43 mg/kg干預(yù)，模型及空白組灌胃相同體積生理鹽水，連續(xù)7 d。除空白組外，均于末次灌胃1 h后，硝酸甘油10 mg/kg皮下注射方法制備大鼠偏頭痛模型。4 h時(shí)采血，ELISA法檢測血清腦啡肽（Enkephalin， ENK）、β內(nèi)啡肽（β-Endorphin， β-EP）含量;免疫組化方法檢測腦干組織C-FOS表達(dá);并觀察各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)。結(jié)果 與空白組比較，模型組動(dòng)物血清ENK含量顯著增高（P<0.05），血清β-EP含量顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，各治療組ENK含量及C-FOS表達(dá)降低（P<0.05），β-EP含量顯著增高（P<0.05）;川芎組ENK含量低于白芷組（P<0.05），川芎組C-FOS表達(dá)低于吳茱萸組（P<0.05）。結(jié)論 3種中藥均能改善偏頭痛動(dòng)物雙耳變紅、撓頭、爬籠、豎耳、皮膚發(fā)紺等行為學(xué)表現(xiàn)，減少ENK分泌，增加β-EP含量，降低C-FOS表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕 偏頭痛;川芎;白芷;吳茱萸;C-FOS;腦干

〔中圖分類號(hào)〕R285.5&nbsp; ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.009

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of single traditional Chinese medicine （TCM）-Radix Angelicae Dahuricae， Fructus Evodiae and Rhizoma Chuanxiong on neurotransmitters and the expression of C-FOS in the brainstem of migraine model rats. Methods A total of 48 Wistar rats were randomly divided into 6 groups （each group of 8 rats）： a blank group， a model group， a Radix Angelicae Dahuricae group （BZ group， 0.79 g/kg）， a Fructus Evodiae group （WZY group， 0.40 g/kg）， a Rhizoma Chuanxiong group （CX group， 0.79 g/kg） and a drug control group （XBL group， 0.43 mg/kg）. Each treatment group was given its respective medicine， while the blank group and the model group were given the same volume of normal saline by gavage， for 7 d. Except for the blank group， the rat model of migraine was prepared by subcutaneous injection of nitroglycerin 10 mg/kg at 1 h after the last gavage. At the end of 4 h， blood was collected. The content of enkephalin （ENK） and β-endorphin （β-EP） in serum was tested by ELISA， and the expression of C-FOS in brainstem was detected by immunohistochemistry （IHC）. And the behavior of each group of rats was observed. Results Compared with the blank group， the content of ENK in serum in the model group was significantly increased （P<0.05）， and the content of β-EP in serum was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the content of ENK and the expression of C-FOS in each treatment group were decreased obviously （P<0.05）， and the content of β-EP was increased significantly （P<0.05）. The ENK content of the CX group was lower than that in the BZ group （P<0.05）， and the C-FOS expression of the CX group was lower than that in the WZY group （P<0.05）. Conclusion The 3 kinds of TCM can improve the behavioral performance of migraine animals such as red ears， head scratching， climbing cage， erect ears and cyanosis， reduce the secretion of ENK， increase the content of β-EP and decrease the expression of C-FOS.

〔Keywords〕 migraine; Rhizoma Chuanxiong; Radix Angelicae Dahuricae; Fructus Evodiae; C-FOS; brainstem

偏頭痛（Migraine）是一種反復(fù)發(fā)作的血管性頭痛，呈一側(cè)或兩側(cè)疼痛，常伴惡心、嘔吐、畏光等癥狀。少數(shù)典型者發(fā)作前有視覺、感覺和運(yùn)動(dòng)等先兆，可有家族史。2010年我國原發(fā)性頭痛流行病學(xué)調(diào)查顯示，偏頭痛發(fā)病率為9.3%。日本偏頭痛患病率為6.0%～8.4%，美國與歐洲約為12%[1]。30歲以下年齡組發(fā)病率有逐年增多的趨勢[2]。

偏頭痛屬于中醫(yī)學(xué)“頭痛”范疇。中醫(yī)藥治療本病經(jīng)驗(yàn)豐富，教材《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》《中藥學(xué)》在論及頭痛、偏頭風(fēng)的治療時(shí)均用到川芎、白芷、吳茱萸，但沒有說明三者功效的差別，僅有“頭痛不離川芎”之說，似乎川芎治療頭痛效果最好，但無明確說明。本實(shí)驗(yàn)利用硝酸甘油（Glyceryltrinitrate， GTN）制備大鼠Migraine模型，觀察三種中藥對腦啡肽（Enkephalin，ENK）、β內(nèi)啡肽（β-Endorphin， β-EP）含量及腦干組織C-FOS表達(dá)的影響，了解三者之間的療效差異，指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠48只，雌雄各半（200±10）g，購于湖北省動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證編號(hào)：42000600012121。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在武漢市第一醫(yī)院屏障動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行，動(dòng)物設(shè)施使用證編號(hào)：00137527。動(dòng)物室內(nèi)12 h晝夜交替，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂維持飼料（北京華阜康公司），自由飲去離子水。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物

白芷、吳茱萸、川芎購于武漢市第一醫(yī)院中藥房，由湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司炮制、包裝，批號(hào)分別為20150912、20150921、201510022。單味中藥浸泡30 min后，大火煎開，改小火30 min，雙層紗布過濾;再加水煎煮一次，合并2次濾液，分別濃縮至0.67 g/mL、0.50 g/mL、0.67 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?硝酸甘油由河南潤弘制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1503302，5 mg/mL;鹽酸氟桂利嗪膠囊（西比靈）由西安楊森生產(chǎn)，批號(hào)150424975，5 mg/粒。

1.3? 儀器及試劑

1.3.1? 儀器? MK3型酶標(biāo)儀（美國熱電）;動(dòng)物室監(jiān)控系統(tǒng)（SONY-GEDVR-WTO）;千屏顯微圖像采集系統(tǒng)（武漢千屏）。

1.3.2? 試劑? ENK、β-EP等指標(biāo)ELISA檢測試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司（批號(hào)分別為10-61-499，10-61-497），組化用兔抗大鼠一抗C-fos（Bioworld， BS6433），組化檢測試劑盒（Servicebio，G1210，含二抗），水合氯醛（上海山浦化工有限公司，AR，批號(hào)20150312）。

1.4? 分組及干預(yù)

48只大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只（雌雄各半），分別為：模型組與空白組分別灌胃2 mL生理鹽水，白芷組按0.79 g/kg質(zhì)量灌胃白芷煎煮液（按人與大鼠體表面積換算）2 mL、吳茱萸組按0.40 g/kg體質(zhì)量灌胃吳茱萸煎煮液2 mL、川芎組按0.79 g/kg體質(zhì)量灌胃川芎2 mL、西比靈組按0.43 mg/kg體質(zhì)量灌胃西比靈混懸液2 mL，連續(xù)7 d;在第7天灌胃1 h后，空白組皮下注射生理鹽水，其他各組均按10 mg/kg劑量皮下注射硝酸甘油[3]。

1.5? 指標(biāo)檢測

1.5.1? 行為學(xué)觀察? 從造模時(shí)起，利用動(dòng)物室監(jiān)控系統(tǒng)，于注射硝酸甘油后連續(xù)攝錄3 h內(nèi)各動(dòng)物的行為（包括耳朵變紅、撓頭、甩頭、爬籠、豎耳、豎毛、皮膚發(fā)紺等現(xiàn)象）。每30分鐘為1個(gè)時(shí)間段，觀察攝錄資料中各組動(dòng)物雙耳紅出現(xiàn)時(shí)間及觀察時(shí)間段內(nèi)動(dòng)物撓頭次數(shù)。撓頭開始時(shí)間以大鼠撓頭次數(shù)>5次以上次為標(biāo)志，消失時(shí)間以撓頭次數(shù)<5次并出現(xiàn)倦怠表現(xiàn)為標(biāo)志[4]。

1.5.2? 血清ENK、β-EP含量檢測? 注射硝酸甘油后4 h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，腹主動(dòng)脈采血（分離膠管盛裝），分離膠管于室溫放置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-80 ℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）按試劑盒說明書操作方法來檢測各組動(dòng)物血清ENK、β-EP含量。

1.5.3? 腦干組織免疫組化檢測? 4%多聚甲醛固定腦干組織經(jīng)常規(guī)方法包埋，將所切白片置于58 ℃烤片1 h;恢復(fù)室溫后將樣本脫蠟至水;微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù);滴加3%雙氧水于玻片上孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再以雙蒸水清洗3次，每次3 min;滴加正常山羊血清室溫下孵育12 min;滴加1∶80稀釋一抗（C-FOS），于濕盒中4 ℃孵育過夜;取出濕盒室溫放置20 min，PBS浸洗3次，每次3 min;滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30 min;PBS浸洗3次，每次3 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育30 min;PBS沖洗3次，每次5 min;新鮮配制DAB染色30 min，流水沖洗2 min;蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精返藍(lán);自來水沖洗后脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，胞漿棕褐色為陽性表達(dá)。用IPP 6.0軟件計(jì)算各組陽性表達(dá)OD值，并與空白組比較計(jì)算各組相對表達(dá)量。

1.6? 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以“x±s”表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。如果方差齊性，即用最小顯著差數(shù)法（LSD）完成組間比較，如果方差不齊，則用Dunnett's T3進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組動(dòng)物行為學(xué)改變

模型組動(dòng)物在3 min左右出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、上肢撓頭頻繁、煩躁、爬籠次數(shù)增加等現(xiàn)象，1～3 h后，現(xiàn)倦怠、活動(dòng)減少等癥狀。空白組未見雙耳發(fā)紅，僅偶爾出現(xiàn)撓頭、爬籠現(xiàn)象。如表1所示，各組動(dòng)物耳紅出現(xiàn)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.831）。

2.2? 各組動(dòng)物不同時(shí)間段撓頭次數(shù)比較

如表1所見，與空白組比較，模型組各時(shí)間段撓頭次數(shù)均顯著增高（P=0.000）;與模型組比較，各個(gè)時(shí)間段3組中藥組撓頭次數(shù)均顯著降低（P=0.000），西比靈組31～60 min段、61～90 min段、91～120 min段、121～150 min時(shí)間段撓頭次數(shù)顯著降低（P值分別為0.000，0.000，0.000，0.000，0.029）;與川芎組比較，0～30 min時(shí)間段白芷組和吳茱萸組撓頭次數(shù)均顯著增高（P值分別為0.001，0.000），91～120 min時(shí)間段吳茱萸組撓頭次數(shù)顯著降低（P=0.004），在31～60 min、61～90 min及151～180 min時(shí)間段白芷組撓頭次數(shù)均顯著增高（P=0.000，0.007，0.020）。

2.3? 各組動(dòng)物血清ENK、β-EP含量比較

與空白組比較，模型組血清ENK含量顯著增高（P=0.004），β-EP含量顯著降低（P=0.002）;與模型組比較白芷組、吳茱萸、西比靈組ENK含量降低（P值分別為0.000，0.001，0.026），白芷組B-EP含量顯著增高（P=0.001）;與西比靈組比較，白芷組ENK含量顯著降低（P=0.036），白芷組、吳茱萸組、川芎組B-EP含量均顯著增高（P值分別為0.000，0.004，0.003）;與川芎組比較，白芷組ENK含量顯著降低（P=0.011），白芷組β-EP含量顯著增高（P=0.026），見表2。

2.4? 各組動(dòng)物腦干C-FOS表達(dá)比較

各組之間C-FOS表達(dá)有顯著差異（方差分別為6.327，P=0.021），進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組C-FOS表達(dá)顯著增高（P=0.033）;與模型組比較，各個(gè)治療組C-FOS表達(dá)均顯著降低（P值分別為0.002，0.025，0.005，0.039）;與西比靈組比較，白芷組C-FOS表達(dá)顯著降低（P=0.042）;川芎組C-FOS表達(dá)顯著低于吳茱萸組（P=0.041），見表2、圖1。

3 討論

偏頭痛是臨床常見的一種慢性神經(jīng)血管病，具有無法根治、反復(fù)發(fā)作并容易伴有精神障礙等特點(diǎn)，對患者生活質(zhì)量影響巨大。大多數(shù)患者發(fā)病時(shí)會(huì)影響學(xué)習(xí)或工作。世界衛(wèi)生組織（WTO）發(fā)布的常見疾病按健康壽命損失年（years lived with disability， YLD）排列中，偏頭痛位列第20位，且將嚴(yán)重偏頭痛定為最嚴(yán)重致殘的慢性疾病，等同于癡呆、癱瘓和嚴(yán)重精神病[5]。因此防治偏頭痛是亟待解決的公共健康課題。

阿片肽系統(tǒng)是參與高級中樞對傷害性刺激內(nèi)源性調(diào)節(jié)的相關(guān)遞質(zhì)之一，是控制痛覺的主要遞質(zhì)，其中ENK和β-EP在腦內(nèi)和脊髓內(nèi)均有鎮(zhèn)痛作用，β-EP在腦內(nèi)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于脊髓，ENK在脊髓發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，而在腦內(nèi)反而有對抗嗎啡鎮(zhèn)痛作用。β-內(nèi)啡肽由31個(gè)氨基酸組成，主要在垂體合成，是β脂肪酸釋放激素的第36～91氨基酸序列，存在于丘腦、垂體、腎上腺及其他外周組織中。有研究認(rèn)為偏頭痛是由于傷害感受系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)功能失調(diào)引起的，β-內(nèi)啡肽是其中最重要的神經(jīng)遞質(zhì)[6]，β-EP釋放減少時(shí)，其抑制去甲腎上腺素神經(jīng)元胞體活性的能力下降導(dǎo)致頸部血管收縮舒張失調(diào)，造成同側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈收縮和頸外動(dòng)脈舒張，與偏頭痛的前驅(qū)期和頭痛期血管變化一致[7]，因此認(rèn)為β-EP具有緩解偏頭痛的作用。

C-FOS基因?qū)儆诩纯淘缙诨颍瑢ι窠?jīng)遞質(zhì)、激素、神經(jīng)沖動(dòng)及外界刺激引起的傳入信息在數(shù)分鐘內(nèi)即可做出反應(yīng)并進(jìn)行表達(dá)，作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物，是細(xì)胞外刺激、激活神經(jīng)元的敏感指標(biāo)，并廣泛用于多種疼痛研究。正常情況下，C-FOS很少表達(dá)，各種如疼痛、創(chuàng)傷等傷害性刺激均可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)C-FOS表達(dá)，其表達(dá)水平與痛覺調(diào)控密切相關(guān)。FOS蛋白與JUN蛋白在胞核中相互連接形成二聚體復(fù)合物，并結(jié)合目的基因中的AP-1位點(diǎn)，進(jìn)一步激活目的基因表達(dá)最終對疼痛刺激作出反應(yīng)[8-10]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，偏頭痛屬于“偏頭風(fēng)”“頭風(fēng)”“腦痛”“偏頭痛”等范疇，系由風(fēng)邪、氣郁、肝陽上擾或痰濁、淤血阻滯腦絡(luò)，不通則痛，發(fā)為本病。通過對《中醫(yī)方劑大辭典》中治療頭痛、偏頭痛方劑的分析發(fā)現(xiàn)，白芷-川芎組合出現(xiàn)的頻率最高，其機(jī)制與抗炎及能量代謝相關(guān)通路有關(guān)[11]。川芎是治頭痛要藥，現(xiàn)代藥理研究也證實(shí)川芎中揮發(fā)油成分有鎮(zhèn)痛作用[12]，白芷能祛風(fēng)止痛，善治頭面部的疼痛，這二味藥在1994-2007年中藥治療偏頭痛的文獻(xiàn)分析中屬于高頻率使用藥物[13];吳茱萸為治療肝寒氣滯諸痛主藥，《傷寒論·辨厥陰病脈證并治》：“干嘔，吐涎沫，頭痛者，吳茱萸湯主之。”

本研究顯示，偏頭痛模型組及各治療組大鼠皮下注射硝酸甘油約4 min時(shí)雙耳變紅，繼而出現(xiàn)煩躁、活動(dòng)增多，前肢及后肢搔頭頻繁，中藥治療組及西比靈治療組動(dòng)物煩躁、撓頭次數(shù)較模型組少，三種中藥組在90 min左右時(shí)搔頭減少，120 min后逐漸開始倦臥，期間有間斷活動(dòng)。在皮下注射硝酸甘油后動(dòng)物血清ENK含量增高，β-EP含量降低，腦干組織C-FOS表達(dá)增高，川芎治療組ENK含量顯著低于白芷組（P<0.05），β-EP含量高于白芷組（P<0.01），C-FOS表達(dá)低于吳茱萸組（P<0.05）。從各組動(dòng)物行為改變看，開始階段川芎治療組撓頭次數(shù)最低，且維持時(shí)間較長;吳茱萸組撓頭次數(shù)梯次降低較快，提示川芎、吳茱萸可能聯(lián)用療效較好。

參考文獻(xiàn)

[1] STOVNER L J， ANDREE C. Prevalence of headache in Europe： a review for the Eurolight project[J]. The journal of headache and pain， 2010，11（4）：289-299.

[2] 袁夢果，劉云芳，田? 婷，等.活血祛風(fēng)法治療偏頭痛的Meta分析[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，23（1）：73-76.

[3] 周? 莉，蔡秀英，倪健強(qiáng).偏頭痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的行為學(xué)評價(jià)[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2016，22（4）：293-297.

[4] 張笑娜，王新來，史文珍，等.偏頭痛動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀[J].中華腦科疾病與康復(fù)雜志（電子版），2014，4（3）：203-206.

[5] 宋丹寧，尚? 坤，李? 娜，等.當(dāng)歸川葛顆粒對硝酸甘油致大鼠偏頭痛的影響及機(jī)制[J].中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2017，37（1）：269-270.

[6] 孫? 達(dá)，許保海.川芎茶調(diào)散治療偏頭痛的療效觀察及對β內(nèi)啡肽、五羥色胺的影響[J].中國中醫(yī)急癥，2016，25（11）：2117-2119.

[7] WU X， ZHANG M， HUANG H. Effect of qilongtoutong granule on calcitonin gene-related peptide， beta-endorphin， serotonin， dopamine， and noradrenalin in migraine model rats and mice[J]. Journal of traditional Chinese medicine， 2014，34（2）：188-193.

[8] SETHI N K， ULLOA C M， SOLOMON G E， et al. Diagnostic utility of routine EEG study in identifying seizure as the etiology of the index event in patients referred with a diagnosis of migraine and not otherwise specified headache disorders[J]. Clinical EEG and Neuroscience， 2012，43（4）：323-325.

[9] RAMACHANDRAN R， BHATT D K， PLOUG K B， et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat[J]. Cephalalgia， 2012，32（1）：73-84.

[10] 趙永烈，王玉來，岳廣欣.芎芷地龍湯對偏頭痛模型大鼠腦組織C-FOS和CGRP蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志，2016，14（9）：957-960.

[11] 蘇? 瑾，唐仕歡，郭非非，等.含白芷方劑組方規(guī)律及核心藥對“白芷-川芎”分子機(jī)制的研究[J].中國中藥雜志，2018，43（7）：1331-1337.

[12] 劉頂鼎，郭建生，曾貴榮，等.芎麻湯及其提取物對利血平低5-HT型偏頭痛模型小鼠的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（3）：17-19.

[13] 劉紅梅.中藥治療偏頭痛文獻(xiàn)綜述[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志.2014，12（10）：1267-1269.