2016-2018年臨床分離銅綠假單胞菌的耐藥情況分析

焦芳艷 尹鐵球 黃露萍 李勇 譚宇蓉

〔摘要〕 目的 分析2016年至2018年湖南省腦科醫院銅綠假單胞菌的臨床分布情況、耐藥情況以及耐藥菌株Ⅰ類整合子基因。方法 選取湖南省腦科醫院2016年1月1日至2018年12月31日臨床送檢各類標本中分離出795株銅綠假單胞菌作為分析對象，就銅綠假單胞菌的臨床分布情況以及耐藥情況統計分析，2018年ICU分離的13株多重耐藥菌株采用PCR擴增檢測Ⅰ類整合子。結果 銅綠假單胞菌分布科室主要為神經外科（24.53%），其次為呼吸內科（22.26%）和重癥醫學科（13.21%）;銅綠假單胞菌對臨床常用的20種抗生素耐藥率和敏感率0-100%不等，多重耐藥呈上升趨勢;13株多重耐藥菌株6株Ⅰ類整合子陽性。結論 及時統計細菌分布情況、藥物的耐藥率、敏感率，并對其進行分析，可以為臨床合理用藥提供依據，有效預防和控制感染。

〔關鍵詞〕 銅綠假單胞菌;抗菌藥物;耐藥率;敏感率

〔中圖分類號〕R378.99+1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.019

〔Abstract〕 Objective To analyze the clinical distribution， drug-resistance and class I integron genes of drug-resistant strains of pseudomonas aeruginosa （PA） in the Brain Hospital of Hunan Province from 2016 to 2018. Methods A total of 795 PA separated from clinical specimens submitted for examination samples in the Brain Hospital of Hunan Province from January 1， 2016 to December 31， 2018 were regarded as analysis objects. The clinical distribution and drug-resistance of PA were statistically analyzed. In 2018， class I integron of 13 multiple drug-resistant strains separated from specimens submitted by ICU were detected by PCR amplification. Results Most of PA was from neurosurgery department （24.53%）， followed by the department of respiratory medicine （22.26%） and the department of critical care medicine （13.21%）. The drug-resistance rate and susceptibility rate of PA to 20 antibiotics commonly used in clinic ranged from 0-100%， with multiple drug-resistance on the rise. The class I integrons were detected positive in 6 of the 13 multiple drug-resistant strains. Conclusion Timely statistics and analysis of bacterial distribution， drug-resistance rate and susceptibility rate could provide the basis for rational drug use in clinics and effectively prevent and control infection.

〔Keywords〕 pseudomonas aeruginosa; antibacterial drug; drug-resistance rate; susceptibility rate

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa， PA）是假單胞菌屬代表菌種，廣泛分布于自然界、土壤、水體、空氣以及人類皮膚、腸道、呼吸道等中，其屬于革蘭陰性桿菌，是一種常見的條件致病菌，是醫院感染的主要病原菌之一[1]。近年來，由于抗生素不合理使用以至于PA成為臨床病原菌的主要菌種之一。由于其易定植、易變異、多重耐藥等特性[2]，導致PA感染已成為臨床治療的瓶頸[3]。所以了解PA的臨床感染的分布情況及藥敏耐藥、敏感特點十分重要，通過這些分析可以為臨床合理用藥提供依據，是加強醫院感染控制的重要措施。

研究顯示，PA的耐藥機制較為復雜，其中包括群體感應系統、碳青霉烯酶、和外排泵等，近年研究也發現在整合子-基因盒系統中介導該菌由單一耐藥向多重耐藥發展過程時擔任重要角色，我國多項研究表明基本為Ⅰ類整合子[4-6]。本研究分析總結了湖南省腦科醫院2016-2018年臨床分離的795株 的臨床耐藥情況，并對2018年分離自ICU的13株多重耐藥菌株的Ⅰ類整合子進行了分析。

1 材料與方法

1.1? 菌株來源及鑒定

選取2016年1月1日至2018年12月31日湖南省腦科醫院患者臨床分離到的（剔除重復標本）PA795株，質控菌株購自衛生部臨床檢驗中心的PA ATCC27853、大腸埃細菌ACTT25922，細菌分離按照《全國臨床檢驗操作規程》第3版[7]處理操作，采用全自動微生物鑒定儀進行細菌鑒定。

1.2? 儀器與試劑

Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀及配套試劑、TDR-300B plus天地人系統微生物鑒定儀及配套試劑，ABsteponeplus基因擴增儀，柯達凝膠成像系統，BIO-RAD電泳儀。DNA提取試劑盒為OMEGA試劑盒。

1.3? 藥敏試驗

藥敏試驗操作、結果判定采用CLSI2016- 2018 年版標準推薦的最低抑菌濃度（MIC）法。多重耐藥銅綠假單胞菌（multiresistant pseudomonas aeruginosa，MRPA）的判定：對下面5類抗菌藥中的3類及以上藥物耐藥包括頭孢菌素類（如頭孢吡肟）、氟喹諾酮類（如左旋氧氟沙星）、碳青霉稀類（如美羅培南）、B-內酰胺酶抑制劑（哌拉西林/他唑巴坦）和氨基糖苷類（妥布霉素）。

1.4? 整合子基因擴增

按照OMEGA試劑盒說明書提取DNA，參考文獻[6]設計引物，引物intⅠ1-F和intⅠ1-R由湖南擎科生物技術有限公司合成，擴增條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 20 s，52.5 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，35 cycle. PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳凝膠成像分析。

1.5? 統計學方法

所有實驗數據采用WHONET 5.6軟件及 SPSS

20.0軟件進行分析。

2 結果

2.1? PA的分離情況

2016年1月1日至2018年12月31日3年臨床共分離細菌6 475株，株數及占比如下：三年共分離795株（795/6475，12.28%），2016年281株（281/ 2269，12.38%），2017年216株（216/1930，11.19%），2018年298株（298/2706，11.01% ）。

2.2? PA在各臨床標本中的分布情況

菌株主要來自住院患者的痰液78.49%（624/ 795）、傷口拭子6.04%（48/795）、支氣管肺泡灌洗液4.78%（38/795）、尿液3.65%（29/795）、血液1.26%（10/795）、其他5.79%（46/795）等，見表1。

2.3? PA在各臨床科室中的分布

本院由銅綠假單胞菌引起感染的臨床科室較為多，幾乎涉及所有科室，主要分布于神經外科、呼吸內科、重癥醫學科、神經內科、腫瘤科等等科室;主要科室株數及占比如下：神經外科分布24.53% （195/795）、呼吸內科22.26%（177/795）、重癥醫學科13.21%（105/795）、神經內科12.08%（96/795）、腫瘤科5.03%（40/795）、其他科室22.89%（182/795）等，具體見表2。

2.4? PA的季節分布

795例PA感染的季節分布，2016-2018年總體是秋季占比率最高，冬季次之，見表3。

2.5? PA對臨床常用抗菌藥物的耐藥性敏感性

從以下監測數據觀察到，我院三年合計PA耐藥高達96.81%，對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、哌拉西林保持相對較高敏感率，對亞胺培南和美羅培南較敏感在60%～70%左右。PA對頭孢唑啉、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢吡肟、氯霉素、氨芐西林舒巴坦耐藥率高。具體數據見表4。

2.6? 與本院2010-2012年PA抗菌藥物耐藥率統計分析

與本院文獻[8]2010-2012年合計統計分析，有11種抗菌藥物的耐藥率統計相同，其中有7種下降，2種上升，明顯下降的有：慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、左旋氧氟沙星、阿米卡星、頭孢吡肟，耐藥率上升的有：頭孢曲松、亞胺培南。

2.7? MRPA檢出率分析

全院在795株PA分離中共分離出MRPA86株10.82%，MDPA在2016-2018年的檢出率分別為6.54%（18/281）、10.9%（10.9/216）、14.77%（44/298），檢出率呈上升趨勢。

2.8? 2018年分離自ICU的13株多重耐藥菌株Ⅰ類整合子分析

分析結果顯示，6株陽性，產物大小約500 bp（見圖1），占46.2%，陽性率和文獻報道相似[5-6]，表明整合子在銅綠假單胞菌的耐藥性發展中起著重要的作用。

3 討論

3.1? PA分布情況

PA是醫院內獲得性感染常見的條件致病菌之一，可引起嚴重的肺炎、菌血癥、燒傷后感染、泌尿系統感染等[9]，在目前醫院感染中發揮重要作用[10]，且其感染率近年來不斷增加[11]。從結果2.1可以看出我院PA在總分離菌株中比例較高，3年比例分布在11.01%～12.38%之間，比湖南省2017年度細菌耐藥監測報告發布的細菌耐藥數據顯示PA占總分離菌株比8.03%，和2016年全國細菌耐藥監測報告發布的數據顯示PA在總分離菌株中約占9.03%都高。所以，本院的患者PA總體感染相對嚴重，醫院需對PA感染者更加嚴密監測和加強相關的研究，一定避免PA在院內大規模的爆發感染。但本院結果顯示近三年來，檢出率有逐漸下降趨勢。說明近些年由于上級部門和醫院開始重視，但各臨床科室并不能掉以輕心。從表2看標本來源廣泛種類多，但還是以痰標本最多且占比高。和近些年統計文獻相同[12-14]。此項顯示，本室更應關注此類型標本及其菌的耐藥情況，對其類型的標本進行進一步研究和總結，為臨床提供更有價值的資料。從表3結果來看菌株科室分布前5名科室神經外科分布占 24.53%、呼吸內科22.26%、重癥醫學科13.21%、神經內科12.08%、腫瘤科5.03%，這可能是神經外科感染來源于患者基本手術及呼吸內科、神經內科患者多為老年病人，患者病程長、病情重、機體免疫力低下，在對重癥科和腫瘤科患者進行搶救時常進行氣管切開及插管等侵入性操作，同時這些患者常常伴有長時間的使用廣譜抗菌藥控制感染，容易引發機體菌群失調進而導致條件致病菌如銅綠假單胞菌感染增加。這與多文獻研究[15-17]基本相符。所以相關臨床科室需要特別注意PA感染的患者，注意每次此菌感染患者的耐藥情況分析及動態病情變化，選擇更適合患者的抗菌藥物，盡量減少患者對此菌的多重耐藥發生。從表4顯示2016-2018年總體是秋季占比率最高。這可能是秋天氣候冷暖善變，晝夜溫差較大，使得呼吸道抵抗力下降有關[13]。這提醒臨床對易感患者尤其注意這個季節需注意天氣和晝夜溫差變化，囑咐患者保暖、加強營養，增強抵抗力，從而預防PA的感染。

3.2? PA耐藥分析

PA具有多重耐藥的特性，其耐藥機制主要包括以下方面：（1）改變細胞膜和細胞壁結構，使其通透性下降，藥物難以進入細胞內;（2）產生藥物滅活酶如純化酶、水解酶和修飾酶;（3）主動轉運系統把抗生素排出;（4）產生β-內酰胺酶使β-內酰胺類抗生素開環失活;（5）改變藥物作用的靶位，抑制細菌細胞壁生物合成，降低其與β-內酰胺類抗生素的親和性[18]。表4數據顯示3年中大多數藥敏的敏感率耐藥率相差不大，在20種抗菌藥物中，合計敏感率高于70%以上有9種，從高至低為：替加環素、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星、環丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他啶、美羅培南。合計敏感率在69%～60%左右有4種，從高至低為：哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林、氨曲南、亞胺培南。合計藥敏的耐藥率高于70%有7種以上從高至低為：氨芐西林、頭孢唑林、頭孢替坦、呋喃妥因、氨芐西林/舒巴坦、頭孢呋辛、頭孢曲松。從3年常規藥敏變化來看：左旋氧氟沙星雖然敏感率較高但逐年略下降，美羅培南和氨曲南（16年沒做）敏感率也是下降。環丙沙星、頭孢他啶敏感性逐年上升。從結果“2.6”顯示，近些年由于管理部門及醫院對抗生素重視管理、控制及監測，本院的銅綠假單胞菌耐藥率呈明顯下降趨勢。從結果“2.7”來看比較近年其他文獻[16]統計MRPA，本院多重耐藥率較低，但是近三年持續上升，而且每年上升比例不少，所以臨床要引起重視。根據以上統計分析，對于單純銅綠假單孢菌感染的患者推薦臨床根據病情使用敏感率高于70%以上9種藥，其中替加環素是目前極少見耐藥的藥物，可用作銅綠假單胞菌感染的患者最后一道防線的藥物之一。而阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素為敏感度較高可作為臨床一線的抗菌藥物。而環丙沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟可以作為目前臨床上較常規安全性選用的抗菌藥物。對于左旋氧氟沙星在安全選用的同時持續關注。而對于敏感率在69%～60%左右的4種及美羅培南來說，臨床要慎重選用。尤其美羅培南、亞胺培南這類碳青霉稀類藥物，近年來耐藥檢測率越來越高，一旦其耐藥可用抗菌藥物就有限，臨床盡量限制性選擇，這與郭良等[19]研究相符。當然，對臨床來說盡量不用耐藥率高于70%的7種藥，而本院也需持續關注這7種耐藥率高的藥物，分析其耐藥機制，為臨床合理用藥提供理論依據。對于復雜難治多種細菌感染，臨床可以根據以上藥敏藥物敏感性聯合搭配選藥，慎用耐藥率高的藥敏藥物。而對MRPA，臨床更應高度重視其耐藥危害性，根據本院提供抗菌藥敏結果結合臨床合理使用抗菌藥物，防止或減慢多重耐藥菌珠的產生。綜上PA耐藥分析，本院更應與臨床加強溝通，更進一步總結分析與研究，為臨床提供及時準確有效抗菌藥物結果。

整合子是一種與耐藥基因水平傳播相關的可移動的基因元件，可以攜帶一個或多個耐藥基因，在同種或不同種的細菌間發生水平傳播，可導致多重耐藥的發生[20]。整合子根據其整合酶編碼基因序列的不同分類，目前發現至少有6種，其中Ⅰ類整合子最為常見[21]。Ⅰ類整合子在醫院感染菌中廣泛分布，而且由于抗菌藥物在全球范圍大量應用，也加速了Ⅰ類整合子流行和播散[4]。本研究初步表明，Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌的耐藥性發展中可能發揮重要作用，我們將進一步加大標本量進行各類整合子基因分析，并進一步結合基因測序技術對整合子可變區中耐藥基因進行研究分析，從而更加明確銅綠假單胞菌耐藥性機制。

3.3? 小結

綜上分析，銅綠假單胞菌致病性較強，臨床分布廣泛，是醫院內感染的重要病原菌。近些年由于管理部門的重視，醫院對藥物關注和監測，對藥物耐藥機制關注與研究，常用抗菌藥物敏感性會越來越多，耐藥率呈下降趨勢。但是我們更不能忽視依然還有許多藥物耐藥率及MRPA持續增高，應該繼續更應嚴格管理抗菌藥物，加強抗菌藥物藥敏檢測，控制醫院感染，有效預防和控制臨床患者的PA感染，為臨床合理有效使用抗菌藥物提供科學依據。

參考文獻

[1] 倪語星，尚? 紅.臨床微生物學檢驗[M].5版.北京：人民衛生出版社，2012：137.

[2] GHOLAMI S， TABATABAEI M， SOHRABI N. Comparison of bifilm formation and antibiotic resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa in human and environmental islates[J]. Microb Psthog，2017，109：94-98.

[3] 劉歡樂，陳舒影，吳小樂.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的檢出率與耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志，2016，26（2）：265-267.

[4] 盧玲玲，潘曉微，潘曉夫.銅綠假單胞菌整合子介導耐藥機制的初步研究[J].中國抗生素雜志，2014，39（6）：462-465.

[5] 谷存國，周? 偉，王興紅，等.多重耐藥銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子基因盒的檢測與耐藥機制研究[J].現代預防醫學，2014，41（14）：2601-2603.

[6] 楊? 明，錢揚會，趙強元，2013-2015年臨床分離銅綠假單胞菌耐藥性及Ⅰ類整合子變化分析[J].國際檢驗醫學雜志，2017，38（7）：886-889.

[7] 中華人民共和國衛生部醫政司.全國臨床檢驗操作規程[M].南京： 東南大學出版社，2006：770.

[8] 向萬忠，任碧瓊.銅綠假單胞菌的耐藥性變遷及耐藥機制[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34（10）：1323-1324.

[9] KIM H S， PARK B K， KIM S K， et al. Clinical characteristics and outcomes of Pseudomonas aeruginosa bactermia in febtile neutropenic children and adolescents with the impact of antibiotic resistance： a retrospective sdudy[J]. BMC Infections Diseases， 2017，17（1）：500.

[10] 辛力華，周? 昕，張? 爽，等.2008-2009年醫院感染銅綠假單胞菌的耐藥分析[J].中華醫院感染學雜志，2012，7（22）：1477-1479.

[11] 吳曉勇，史俊敏，伍賢鼎.385株銅綠假單胞菌臨床分布與耐藥性分析[J].檢驗醫學與臨床.2013，10（1）：126-127.

[12] 張艷芳，馮廣滿.中山地區銅綠假單胞菌耐藥性及亞胺培南耐藥機制分析[J].南昌大學學報（醫學版），2018，58（21）：21-22.

[13] 陳約慧，應芙蓉，詹玲玲，等.1543株銅綠假單胞菌感染的臨床分布與耐藥性分析[J].中國臨床藥理學雜志，2016，34（24）：2814-2817.

[14] 林麗容.銅綠假單胞菌分布及耐藥情況分析[J].臨床合理用藥，2018，11（12）：112-113.

[15] 黃興富，范? 華.銅綠假單胞菌的臨床分布及對環丙沙星耐藥機制的研究[J].中國實驗診斷學，2014，18（3）：437-440.

[16] 方平安，熊域皎，鮑永強，等.836株銅綠假單胞菌的臨床分布及耐藥性分析[J].實用醫院臨床雜志，2018，15（5）：201-204.

[17] 張? 泳，林麗英.住院患者銅綠假單胞菌感染分布、耐藥狀況及預后影響因素[J].檢驗醫學與臨床，2018，15（24）：3786-3787.

[18] STOVER C K， PHAM X Q， ERWIN A L， et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1， an opportunistic pathogen[J]. Nature， 2000，406（6799）：959-964.

[19] 郭? 良，肖秀飛，左? 娟，等.多重耐藥銅綠假單胞菌院內感染的耐藥性研究[J].中外醫療，2017，31：185-187.

[20] 姜習新.多重耐藥的銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子與其多重耐藥基因的相關性分析[J].檢驗醫學與臨床，2012，9（3）：300-302.

[21] GAUR A， PRAKASH P， ANUPURBA S， et al. Possible role of integrase gene polymerase chain reaction as an epidemilolgical marker：study of multidrug-resistant acinetobacter baumannii isolated? from nosocomial infections[J]. International Journal of Antimicrobial Agents， 2007，29（4）：446-450.