藍莓葉片誘導愈傷組織最適培養基的研究

陶興魁 高貴珍 張興桃

摘要：目的：為了篩選藍莓葉片誘導愈傷組織的最適培養基，借助藍莓試管苗無性繁殖的優點使其快速繁殖.方法：利用藍莓葉片作為外植體誘導愈傷組織的生成，選擇不同種類的基礎培養基及不同濃度組合的植物生長調節劑設計正交實驗以找出最適宜藍莓葉片誘導愈傷組織的培養基.結果和結論：WPM1/2基本培養基誘導愈傷組織效果最好，NAA對藍莓葉片誘導愈傷組織影響最大，藍莓葉片誘導愈傷組織的最適培養基為WPM1/2+0.5mg·L-1 ZT+1.0mg·L-1 IAA+0.15mg·L-1 NAA.

關鍵詞：藍莓葉片;愈傷組織;正交試驗;培養基

中圖分類號：S663.9? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2019）06-0032-04

藍莓（blueberry）又被稱為越橘或藍漿果，藍莓是“漿果之王”，它的果皮相對較薄，有著自己獨特的風味以及豐富的營養成分，味道酸甜[1].藍莓的果實中存在較多的營養組分，被國際糧農組織列為五大健康食品之一[2-3].藍莓被譽為“黃金漿果”在我國具有很好的市場發展前景[4-5].藍莓常規繁殖速度較慢，且病毒感染嚴重，品種容易退化[6-7]，利用組織培養則繁殖速度較快，且能保持品種特性[8].國內外對于藍莓組培研究，多集中對藍莓莖段或芽、莖尖等外植體誘導植株再生的研究[9-12]，但是較少的研究涉及以藍莓葉片為外植體誘導愈傷組織的研究.在本實驗中，采用藍莓的葉片作為外植體，在試驗中采用單因素實驗對MS培養基、改良MS培養基、WPM培養基、WPM1/2培養基、1/2WPM培養基進行篩選.然后利用ZT、NAA、IA三種激素之間的不同濃度組合來設計正交試驗，研究藍莓葉片誘導的愈傷組織的最適培養條件.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

苗圃園藍莓幼嫩葉片.

1.1.2 試劑材料

IAA、NAA、ZT、瓊脂、蔗糖、消毒劑等.

1.1.3 實驗場所及儀器

組培室、無菌操作臺、紫外燈、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、稱量紙、皮筋、封口膜、三角燒瓶（500ml）、量筒（500ml、1000ml）、燒杯（500ml、1000ml）、長鑷子、記號筆、培養皿、酒精燈、恒溫水浴鍋、玻璃棒等.

1.2 方法

1.2.1 外植體的選擇和滅菌

幼嫩葉片，用清水浸泡，溫度控制在20℃～25℃，用自來水沖洗3h，剪取1.0～1.5cm見方的塊，用清水反復沖洗，然后在超凈工作臺上用75%酒精溶液處理30s，無菌水沖洗數次，再用1%升汞溶液浸泡5min，用無菌水沖洗5～6次，沖洗速度先快后慢.

1.2.2 培養基的篩選

分別以MS培養基、改良的MS培養基、WPM培養基、1/2WPM培養基（WPM中大量元素減半）、WPM1/2培養基（WPM中各組分減半）為基本培養基，添加1.0mg·L-1IAA，0.5mg·L-1ZT篩選適合葉片誘導愈傷組織的基本培養基.

1.2.3 葉片愈傷組織的誘導

以正交實驗因素水平表為依據，采用L9（33）正交表配制9種培養基，葉片剪成1.0～1.5厘米見方的塊，在無菌條件下接種于培養基中，每種培養基接種20瓶，每瓶種4～5個，重復3次，經過30d培養統計出愈率，觀察愈傷組織的長勢.

1.2.4 實驗結果評定指標

出愈率（%）=誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體的總數×100%.

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對藍莓葉片誘導愈傷組織的影響

2.1.1 結果

將適量處理好的葉片接種到MS、改良的MS、WPM、1/2WPM、WPM1/2五種培養基上，經過一段時間后，部分葉片出現卷曲、邊緣開始出現一些白色的小顆粒，愈傷組織開始生成（圖1-2），30d后統計結果并記錄.

通過對表3的分析可知，培養基有利于藍莓葉片愈傷組織的程度由大到小的順序是WPM1/2>改良MS>WPM>1/2WPM>MS，這表明WPM1/2最適宜葉片誘導愈傷組織的生成.

2.2 不同濃度配比的植物生長劑對藍莓葉片誘導愈傷組織的影響

2.2.1 結果

在WPM1/2基本培養基中加入不同濃度的ZT、NAA、IAA植物生長劑，在接種20d后同樣也會發生葉片邊沿卷起，葉片邊緣開始出現少量白色的小顆粒（圖3-6），30d后統計出愈率.

通過對表4的極差分析，極差R值越大表示該因素的影響也較大，所以對藍莓葉片誘導愈傷組織的影響大小為NAA>IAA>ZT，這說明NAA對于出愈率的影響最大.可以看出當NAA濃度增大時，出愈率也會隨之增加.表中K值越大說明這個水平較高，由表4可以得出，ZT的均值K1>K2>K3，IAA的均值K2>K3>K1，NAA的均值K3>K2>K1，正交實驗是較為均一的實驗，只是全部實驗中一部分，所以在表中未被表現出來，通過實驗分析說明最優的處理組合為A1B2C3.同時通過圖3、圖4、圖5、圖6看出，藍莓葉片誘導的愈傷組織在生長過程中會出現由淺綠色變褐色的現象，并且愈傷組織的疏松程度也不同，有的葉片生成的愈傷組織較密，然而有的葉片生成的愈傷組織較為疏松.

正交試驗是一種均一性設計試驗，不可能包含全部處理組合，因此A1B2C3在實驗中就沒有顯現出來.為驗證A1B2C3是最優組合，配制此種培養基20瓶進行驗證試驗.表5表明，AA1B2C3組合愈傷組織出愈率達到93.3%，明顯高于正交表中的9種培養基，進一步對比分析圖片（圖7、圖8）可以發現，兩張圖片中的愈傷組織顏色不相同，圖7中的葉片為綠色，并且較為疏松，而圖8中的愈傷組織為淺黃色，并且較為密集，長勢明顯較好.這說明A1B2C3組合的培養基確實比5號培養基更適合藍莓葉片誘導愈傷組織生長，這也就是證實了藍莓葉片誘導愈傷組織的最適的處理實驗組合為WPM1/2+0.5 mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.

為了能夠更準確分析植物生長劑對藍莓葉片誘導愈傷組織的影響，因此也進行了方差分析，結果表明NAA具有顯著性，說明NAA對于藍莓葉片誘導愈傷組織的影響最大，此結果和極差分析中的結果相符.

3 結論和討論

通過實驗探究表明藍莓組織培養的基本培養基中，MS培養基、改良MS培養基、WPM培養基、WPM1/2培養基、1/2WPM培養基均能使藍莓葉片誘導愈傷組織，從實驗數據分析得出WPM1/2培養基的效果最好.實驗采用NAA生長素、IAA生長素、ZT分裂素之間的組合，結果得到NAA對于藍莓葉片誘導愈傷組織影響最大，并且隨著NAA濃度的增大，出愈率也隨之增大.對于藍莓葉片誘導的愈傷組織的適合培養條件為WPM1/2+0.5mg·L-1ZT+1.0mg·L-1IAA+0.15mg·L-1NAA.在實驗中還發現藍莓愈傷組織在未接種到分化培養基之前，經過一段時間的生長后會出現不同的變化，即有的愈傷組織由綠色變為褐色，有的愈傷組織由白色變為淡黃色，且愈傷組織較為密集.

本實驗中也存在一些的不足，一方面在實驗中會出現一定的葉片污染，因此在以后的實驗中要更加注意實驗過程中的滅菌;另一方面，在實驗中發現藍莓愈傷組織出現了不同程度的褐化現象，可能是植物生長調節劑的濃度或者彼此之間濃度配比不同所導致，這些問題在以后的實驗中有待進一步研究.

參考文獻：

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