滌痰湯糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制

楊光磊 王國(guó)強(qiáng) 米佳

摘要 目的：觀察滌痰湯對(duì)糖尿病大鼠認(rèn)知能力的影響，并探討其對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)因子的影響。方法：將30只SD鼠納入研究，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組及滌痰湯組，其中模型組及滌痰湯組大鼠均接受糖尿病模型制備，滌痰湯組用0.88 g/mL滌痰湯藥液灌胃，正常對(duì)照組及模型組用等量的生理鹽水灌胃，3組均連續(xù)灌胃28 d。各組采用水迷宮評(píng)估大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，Tunel檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞調(diào)亡情況，HE染色法觀察海馬組織病理結(jié)構(gòu)改變，Western blotting法檢測(cè)各組海馬組織PI3K、AKT、p-AKT、Bax及Bcl-2蛋白水平變化。結(jié)果：滌痰湯可明顯改善糖尿病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制神經(jīng)元凋亡率及Bax水平，增加海馬區(qū)PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)論：滌痰湯可明顯改善糖尿病模型大鼠的認(rèn)知，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 糖尿病模型;學(xué)習(xí)記憶能力;滌痰湯;水迷宮;海馬;凋亡;PI3K-AKT信號(hào)通路;神經(jīng)保護(hù)

Abstract Objective：To observe the effects of Ditan decoction on cognitive ability of diabetic rats and to explore the effects of Ditan decoction on PI3K-AKT signaling pathway related factors.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into a normal control group，a model group and a Ditan decoction group.tTe rats in the model group and the Ditan decoction group were all prepared by the diabetic model，and the rats in the Ditan decoction group were treated with 0.88 g/mL Ditan decoction by gavage.The normal control group and the model group were given the same amount of normal saline intragastrically，and the 3 groups were continuously intragastrically administered for 28 days.The learning and memory function of rats in each group was evaluated by water maze，and the apoptosis of neurons was detected by tunnel.The pathological changes of hippocampus were observed by HE staining，and the levels of PI3K，AKT，p-AKT，Bax and Bcl-2 protein in hippocampus of each group were detected by Western blotting.Results：Ditan decoction could significantly improve the learning and memory ability of diabetic rats，inhibited the neuronal apoptosis rate and the level of Bax，and increased the expression of PI3K，p-AKT and Bcl-2 protein in hippocampus.Conclusion：Ditan decoction can significantly improve the cognition of diabetic rats，and its mechanism may be related to the mediation of PI3K/AKT signaling pathway.

Key Words Diabetic model; Learning and memory ability; Ditan decoction; Water maze; Hippocampal; Apoptosis; PI3K-AKT signaling pathway; Neuroprotection

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.021

近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者意識(shí)到研究糖尿病對(duì)認(rèn)知的損傷具有重要臨床意義，有文獻(xiàn)[1-2]證實(shí)高血糖是導(dǎo)致認(rèn)知障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，糖尿病患者罹患血管性癡呆的比例是普通人群的2.5倍，解剖學(xué)顯示糖尿病腦病的病理變化與阿爾茨海默病（Alzheimersdisease，AD）即為相似，因此糖尿病患者是血管性癡呆的高危人群。

糖尿病腦損害引發(fā)的認(rèn)知障礙屬于中醫(yī)學(xué)“健忘”“善忘”“呆病”等范疇，“百病多由痰作祟”“怪病多痰”，現(xiàn)代中醫(yī)從“痰”入手治療認(rèn)知相關(guān)性疾病亦確有療效。滌痰湯源自明代方賢著的《奇效良方》，具有滌痰開(kāi)竅的功效，現(xiàn)代中醫(yī)將其大量應(yīng)用于認(rèn)知及情志相關(guān)的疾病治療[3-5]，獲得了較為理想的療效。但對(duì)其作用機(jī)制目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，由此本團(tuán)隊(duì)以糖尿病模型為觀察對(duì)象，探討其相關(guān)機(jī)制，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 30只SPF（Speciifc Psthogen Free）級(jí)SD雄性大鼠納入本研究，均購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物有限公司;許可證號(hào)為scxk（湘）2014-0010，scxk（湘）2014-0011。體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量（201±1.92）g，鼠齡4～6個(gè)月，平均鼠齡（5±0.11）個(gè)月。所有大鼠均飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，室溫控制在（22±1）℃，濕度（54±2）%，12 h/12 h交替光照。

1.1.2 藥物 制備滌痰湯藥液，成分如下：人參15 g、制南星10 g、生姜10 g、法半夏10 g、枳殼10 g、茯苓15 g、橘紅10 g、甘草3 g、竹茹10 g。整方藥材置于全自動(dòng)煎藥機(jī)中浸泡30 min，水煎煮后濾出藥液，再次加水煎煮后濾出藥液，將2次藥液混勻后濃縮為0.88 g/mL的藥液，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 儀器與試劑 Morris水迷宮（購(gòu)自江蘇賽昂斯公司），Model68酶標(biāo)儀（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories），全自動(dòng)煎藥機(jī)（購(gòu)自濟(jì)南玖延機(jī)械廠）;PI3K一抗抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司，4249T）、AKT一抗抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司，46855）、p-AKT一抗抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司，40605）、Bcl-2一抗抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司15071T），Bax一抗抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司，14796S）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將30只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組、模型組和滌痰湯組，每組10只。3組大鼠在鼠齡、體質(zhì)量、飼養(yǎng)環(huán)境等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。其中正常對(duì)照組予自由飲水及攝食，模型組及滌痰湯組大鼠參照參考文獻(xiàn)[6]予高脂飲食連續(xù)喂養(yǎng)4周，禁食24 h后按照35 mg/kg比例腹腔注射鏈脲佐菌素溶液，正常對(duì)照組相同比例腹腔注射檸檬酸緩沖液，72 h取尾靜脈血測(cè)血糖，當(dāng)血糖≥11.1 mmol/L時(shí)視為造模成功。將造模成功的大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力，根據(jù)文獻(xiàn)[6]可知成模后第10周大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，故我們從成模后第10周開(kāi)始中藥干預(yù)。

1.2.2 干預(yù)方法 正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)，按照0.88 g/（mL·d）比例灌胃生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃28 d后處死;模型組成模后按照0.88 g/（mL·d）比例灌胃生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃28 d后處死。滌痰湯組成模后滌痰湯灌胃干預(yù)，按照0.88 g/（mL·d）予中藥湯劑灌胃，1次/d，連續(xù)治療28 d后處死。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 行為學(xué)檢測(cè) 1）Morris水迷宮測(cè)試：連續(xù)干預(yù)28 d后將各組大鼠置于Morris水迷宮總進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)，水迷宮直徑214 cm，高50 cm，底黑，水池均分為4個(gè)部分，分別標(biāo)記成第一象限、第二象限、第三象限及第四象限。水池里注入清水，高30 cm，池中設(shè)置一圓形平臺(tái)，直徑大小約10 cm，記錄視頻放置于平臺(tái)正上方。2）定位航行實(shí)驗(yàn)：在平臺(tái)象限外隨機(jī)選取一個(gè)入水點(diǎn)，將各組大鼠頭部背對(duì)平臺(tái)放入水中，記錄大鼠找到平臺(tái)時(shí)間，記錄成逃避潛伏期。如大鼠在2 min內(nèi)無(wú)法找到平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)上，并停留15 s，并將該只大鼠的逃避潛伏期記錄為120 s。每天選取不同入水點(diǎn)，3次/d，將所有記錄的逃避潛伏期取平均值。3）空間探索實(shí)驗(yàn)：步驟結(jié)束后將池內(nèi)的平臺(tái)拆除，將大鼠頭部背對(duì)平臺(tái)放入原先平臺(tái)所在象限對(duì)側(cè)象限，觀察120 s，記錄大鼠游過(guò)原平臺(tái)象限區(qū)域的次數(shù)。

1.2.3.2 HE染色觀察海馬病理結(jié)構(gòu)改變 干預(yù)結(jié)束后從各組隨機(jī)選取3只大鼠，充分麻醉后灌流4%多聚甲醛溶液，隨后快速取出腦組織后分離出海馬，并隨機(jī)置于4%多聚甲醛溶液中。將標(biāo)本置于包埋盒中，用流水充分去除固定液，持續(xù)30 min。用70%乙醇60 min-80%乙醇120 min-90%乙醇60 min-95%乙醇10 min-無(wú)水乙醇I 120 min-無(wú)水乙醇II 120 min進(jìn)行脫水后將樣本置于二甲苯I 20 min-二甲苯II 20 min進(jìn)行標(biāo)本透明，隨后將透明的樣本置于55 ℃蠟I 60 min-蠟II 60 min中進(jìn)行包埋，修塊，切片（厚度5 μm），撈片至載玻片后放置于45 ℃恒溫箱中烘干。染色前將樣本玻片置于烤片機(jī)上烤片 30 min，在二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯20 min進(jìn)行脫蠟，再用梯度乙醇復(fù)水，用蘇木素染色5 min后流動(dòng)水沖洗1 min，再用1%鹽酸乙醇分化3 s，流動(dòng)水沖洗1 min，用事先配置好的0.01 mol/L PBS溶液返藍(lán)1 min，流動(dòng)水沖洗1 min，在脫水、透明，封片，隨后將玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3.3 Tunel染色 取材及制片過(guò)程同1.2.3.2，按照Tunel試劑盒操作步驟對(duì)各組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，DAPI染色后呈現(xiàn)染色熒光的代表細(xì)胞核，綠色熒光代表凋亡神經(jīng)元細(xì)胞，在激光共聚焦下顯色并拍照，每個(gè)腦片選取5個(gè)觀察視野，將所得結(jié)果用Image.ProPlus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理。凋亡細(xì)胞率=（綠色熒光的凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.3.4 Western blotting檢測(cè)海馬組織PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的變化 每組隨機(jī)抽取3只大鼠。全麻后取出海馬組織，切成約100 mg，加1 mL蛋白裂解液，室溫放置30 min，4 ℃，15 000 r/min離心5 min，取上清液備用。取25 μL，用BCA法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，按樣品緩沖液比例=4∶1將樣品均勻混合，在100 ℃水浴中加熱變性7 min，然后迅速置于冰上冷卻。儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱內(nèi)備用。然后，根據(jù)所計(jì)算的樣品量，將樣品添加到預(yù)先制備的SDS-PAGE凝膠孔中，電泳，將目標(biāo)蛋白膜轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用封閉溶液密封PVDF膜，密封后，將PVDF膜在TBS中漂洗3次，進(jìn)行5 min/次后，以1∶500比例稀釋?duì)?actin、PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、4 ℃，用一抗稀釋液孵育過(guò)夜，在TBS中沖洗3次，每次5 min后，在室溫下孵育標(biāo)有堿性磷酸酶（用二級(jí)抗體稀釋液稀釋1∶2 000）的山羊抗兔IgG 1 h，然后然后用TBS沖洗3次，5 min/次，然后將ECL顯影劑滴入PVDF膜中進(jìn)行顯影，并用計(jì)算機(jī)掃描圖像，并用BIO RAD圖像軟件（BioRad，Model Gel Doc 2000，美國(guó)）進(jìn)行分析和處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布的用配對(duì)t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的用秩和檢驗(yàn);多組計(jì)量資料采用單因素方差分析，方差齊用LSD法檢驗(yàn)，不齊則用Tamhane′s法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)改變 模型組及滌痰湯組大鼠逃避潛伏期較正常對(duì)照組延長(zhǎng)（P<0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)減少（P<0.05），其中滌痰湯組明顯較模型組改善（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率比較 模型組及滌痰湯組大鼠神經(jīng)元凋亡率明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），其中滌痰湯組明顯較模型組降低（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

2.3 HE染色結(jié)果 HE染色提示正常對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，模型組及滌痰湯組大鼠海馬組織均出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形腫脹，其中滌痰湯組海馬結(jié)構(gòu)較模型組改善。見(jiàn)圖3。

2.4 各組大鼠PI3K-AKT信號(hào)通路標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況 Western blotting結(jié)果顯示，模型組及滌痰湯組大鼠海馬組織PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白水平較正常對(duì)照組降低（P<0.05），Bax較正常對(duì)照組升高（P<0.05）其中滌痰湯組較模型組改善（P<0.05）。見(jiàn)表4、圖4。

3 討論

糖尿病致認(rèn)知功能主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)力、記憶力、執(zhí)行力、計(jì)算力、理解力等減退，嚴(yán)重影響患者的日常生活自理能力。不同糖尿病患者伴發(fā)認(rèn)知障礙臨床癥狀雖然表現(xiàn)各異，但學(xué)習(xí)記憶能力下降為核心癥狀[7]。本研究利用Morris水迷宮檢測(cè)糖尿病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示接受造模的大鼠逃避潛伏期較正常對(duì)照組延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，這提示糖尿病確導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶受損。我們進(jìn)一步HE染色檢測(cè)糖尿病模型大鼠海馬組織的病理結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組大鼠比較，糖尿病模型大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯變形腫脹，這提示糖尿病致認(rèn)知障礙與海馬結(jié)構(gòu)變化息息相關(guān)，這與諸多文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[8-10]。

早在宋代名著《圣濟(jì)總錄》中既有記載：“消渴日久，健忘怔忡”;《蘭室秘藏》中亦提及：“消渴久則，…喜怒善忘”，這均說(shuō)明糖尿病是引起認(rèn)知能力受損的重要原因。古籍并無(wú)“糖尿病伴認(rèn)知障礙”的病名，后世醫(yī)家根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸屬于“健忘”“善忘”“呆病”等范疇，但其病因與其他原因引起的“呆病”不同，消渴病是該病明確的病因，故又將其稱(chēng)之為“消渴病兼證呆癥”。而對(duì)于此病的治療早在明代既有記載，張景岳在《景岳全書(shū)·雜證謨》中描述：“癡呆證，凡平素?zé)o痰…或以不遂…或疑貳…而兼致癡呆…其證則千奇萬(wàn)怪…”;《辨證錄》中亦有記載：“治呆無(wú)奇法，治痰即治呆”。現(xiàn)代臨床基于“痰邪致病”理論用滌痰湯有效治療健忘、癡呆等神志相關(guān)性疾病[11-13]。滌痰湯首載于明代《奇效良方》，具有滌痰開(kāi)竅的功效，方中人參、茯苓健脾益氣，氣旺痰消杜生痰之源，法半夏燥濕化痰，制南星祛風(fēng)痰而止痙，可助半夏燥濕化痰之功，枳殼、橘紅行氣，使氣順則痰消，竹茹可清熱化痰，甘草調(diào)和諸藥為使藥，全方共奏益氣化痰、清濁開(kāi)竅之功。本研究發(fā)現(xiàn)滌痰湯提高了糖尿病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)明顯改善了模型鼠海馬組織病理結(jié)構(gòu)，這提示海馬是滌痰湯有效改善糖尿病后認(rèn)知障礙的靶器官。

在對(duì)滌痰湯作用機(jī)制研究中我們對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，隨著研究的不斷深入，學(xué)者[14-15]認(rèn)為神經(jīng)元凋亡程序的異常改變與糖尿病伴認(rèn)知障礙的關(guān)系密切，而PI3K-AKT信號(hào)通路是凋亡相關(guān)的經(jīng)典通路，PI3K是該通路重要因子，在某種因素刺激下PI3K激活，隨之誘發(fā)細(xì)胞膜上肌醇發(fā)生磷酸化[16]，進(jìn)一步誘發(fā)其下游第二信使PIP3的形成，并隨之結(jié)合Akt，并誘導(dǎo)其構(gòu)象產(chǎn)生變化后出現(xiàn)核位移，誘發(fā)AKT磷酸化而生成p-AKT[17-18]，啟動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡程序。Bcl-2與Bax與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡息息相關(guān)，二者在凋亡程序中發(fā)揮的作用相反，當(dāng)Bcl-2占據(jù)優(yōu)勢(shì)時(shí)主要表現(xiàn)為抗凋亡，反之Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)發(fā)揮促凋亡效應(yīng)[19]。因此Bcl-2與Bax水平直接決定神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的走向。結(jié)果顯示模型組及滌痰湯組大鼠海馬組織PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白水平較正常對(duì)照組降低，Bax較正常對(duì)照組升高，其中滌痰湯組較模型組改善。這一結(jié)果提示滌痰湯的確的確引起了PI3K-AKT信號(hào)通路的標(biāo)志性蛋白表達(dá)的改變，其作用機(jī)制確與PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞異常凋亡有關(guān)。

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（2019-03-11收稿 責(zé)任編輯：王明）