益氣化瘀法改善慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝的研究

唐詠 孫志佳 侯樂

摘要 目的：探討益氣化瘀法改善慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝的效果。方法：選取健康雄性Wistar大鼠60只，隨機分為假手術組、纈沙坦組、中成藥組、模型組，每組15只。建立氣虛血瘀型慢性心力衰竭大鼠模型。術后第9周，氣虛血瘀型慢性心力衰竭大鼠造模成功后，模型組、中成藥組、纈沙坦組、假手術組，進行實驗用藥干預，模型組大鼠每天肌注生理鹽水1 mL，連續4周;中成藥組大鼠每天肌注黃芪注射液、丹參注射液各0.5 mL，連續4周;纈沙坦組按20 mg/（kg·d）的劑量灌胃，連續4周;假手術組每天肌注生理鹽水1 mL。連續4周。比較各組大鼠心室肌細胞橫截面積、心功能指標和心肌組織磷酸腺苷變化。結果：模型組、纈沙坦組和中成藥組心室肌細胞橫截面積大于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;纈沙坦組和中成藥組心室肌細胞橫截面積小于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;中成藥組心室肌細胞橫截面積小于纈沙坦組，差異有統計學意義（P<0.05）。模型組、纈沙坦組和中成藥組LVEF和LVFS低于假手術組，而LVESD和LVEDD高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;纈沙坦組和中成藥組LVEF和LVFS高于模型組，而LVESD和LVED低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;中成藥組LVEF和LVFS高于纈沙坦組，差異有統計學意義（P<0.05）;而中成藥組和纈沙坦組LVESD和LVED比較，差異無統計學意義（P>0.05）。模型組、纈沙坦組和中成藥組ATP和ADP低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;纈沙坦組和中成藥組ATP和ADP高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;中成藥組ATP和ADP高于纈沙坦組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：益氣化瘀法可明顯改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝，具有重要研究意義。

關鍵詞 益氣化瘀法;黃芪注射液;丹參注射液;纈沙坦;慢性心力衰竭;心室肌細胞橫截面積;心功能;心肌組織磷酸腺苷

Abstract Objective：To discuss the effects of qi-boosting and stasis-dissolving method on myocardial energy metabolism in rats with chronic heart failure.Methods：A total of 60 healthy male Wistar rats were divided into four groups，the sham-operation group，the valsartan group，the Chinese patent medicine group and the model group，with 15 rats in each group.Rat model of chronic heart failure with qi deficiency and blood stasis was established.Nine weeks after the model establishment operation，the model group，the Chinese patent medicine group，the Valsartan group and the sham-operation group began receiving experimental medical intervention：rats in the model group received intramuscular injection with 1 mL of normal saline every day for 4 weeks consecutively; the rats in the Chinese patent medicine group were intramuscularly injected with 0.5 mL of Astragalus membranaceus injection and Salvia miltiorrhiza injection respectively every day for 4 weeks consecutively; the Valsartan group was administered 20 mg/（kg·d）of Valsartan every day for 4 weeks consecutively，and the sham-operation group received intramuscular saline 1 mL every day for 4 weeks consecutively.The cross-sectional area of ventricular myocytes，cardiac function and changes of myocardial adenosine monophosphate of rats in each group were compared.Results：The cross-sectional area of ventricular myocytes in the model group，the Valsartan group and the Chinese patent medicine group was higher than that of the sham-operation group（P<0.05）; the cross-sectional area of ventricular myocytes in the Valsartan group and the Chinese patent medicine group was lower than that of the model group（P<0.05）; the cross-sectional area of ventricular myocytes in the Chinese patent medicine group was lower than that of the Valsartan group（P<0.05）.The levels of LVEF and LVFS in the model group，the Valsartan group and the Chinese medicine group were lower than that of the sham-operation group，while the levels of LVESD and LVEDD were higher than that of the control group（P<0.05）; the levels of LVEF and LVFS in the Valsartan group and the Chinese patent medicine group were higher than that of the model group，and the levels of LVESD and LVED were lower than that of the model group（P<0.05）; the levels of LVEF and the LVFS in the Chinese patent medicine group were higher than those of the Valsartan group（P<0.05）.There was no statistical significance in the levels of LVESD and LVED between the Chinese patent medicine group and the Valsartan group（P>0.05）.The levels of ATP and ADP were lower in the model group，the Valsartan group and the Chinese medicine group than in the sham-operation group（P<0.05），and the levels of ATP and ADP in the Valsartan group and the Chinese patent medicine group were higher than that in the model group（P<0.05）; and the levels of ATP and ADP in the Chinese patent medicine group were higher than those of the Valsartan group（P<0.05）.Conclusion：The qi-boosting and stasis-dissolving method can significantly improve myocardial energy metabolism in rats with heart failure，and has important research significance.

Key Words Qi-boosting and stasis-dissolving method; Astragalus Injection; Salvia Miltiorrhiza Injection; Valsartan; Chronic heart failure; Cross section area of ventricular myocytes; Cardiac function; Adenosine phosphate in myocardial tissue

中圖分類號：R256;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.022

慢性心力衰竭（簡稱慢性心衰）是臨床常見的一種疾病，目前已明確導致心力衰竭發生發展的基本機制是心肌重構[1]。衰竭心肌中心肌底物利用和能量代謝的改變，促進心肌重構和慢性心衰的病程進展[2]。其中能量代謝異常是慢性心衰發病過程中的重要環節[3]。中醫臨床研究發現心力衰竭屬本虛標實之證，心氣不足是貫穿于心力衰竭病程中最基本的病理機制，血瘀則為氣虛的病理產物，氣虛血瘀證是慢性心衰的重要類型[4-6]。益氣活血化瘀類中藥是否能通過調控缺血心肌組織中能量代謝的變化以起到逆轉心肌重構的作用，目前尚未見報道。本文研究旨在探討益氣化瘀法改善慢性心衰大鼠心肌能量代謝的效果，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠60只，體質量（200±20）g，購于中國科學院上海動物中心，許可證號：SYXK（滬）2013-0060，適應性喂養2周，自由飲水、飲食。

1.1.2 藥物 纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司生產），黃芪注射液（哈爾濱珍寶制藥有限公司生產），丹參注射液（齊齊哈爾制藥有限公司生產）。

1.1.3 試劑與儀器 Logiq9彩色超聲診斷儀、TKR-200C小動物呼吸機、多導聯生理記錄儀。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 健康雄性Wistar大鼠60只，通過計算機隨機程序，分為假手術組、纈沙坦組、中成藥組、模型組共4組，每組15只。分籠喂養（每籠為同組的動物5只），自由攝食飲水。每日早晚喂食，隔日換水。每日明暗時間各為12 h，模擬白天和黑夜，室溫控制在23～26 ℃，濕度50%左右。在實驗開始后有2周的適應期，使動物熟悉環境。

氣虛血瘀型慢性心衰造模方法：1）采用結扎Wistar大鼠冠狀動脈左前降支，造成心肌梗死8周的心氣虛型慢性心力衰竭模型：麻醉采用水合氯醛（30 mg/kg，腹腔注射），取大鼠仰臥位進行固定，經大鼠喉氣管插管術，連接小動物呼吸機，進行人工呼吸，潮氣量0.7～0.8 mL，頻率80次/min，根據大鼠體質量進行調節，用彎剪進行胸部去毛，用針形電極刺入四肢及胸壁皮下，與心電圖機相連，描記正常心電圖。局部消毒，在左側第3、4肋間，橫向切開皮膚長約1.5 cm，鈍性分離軟組織，可見胸骨及肋軟骨，沿3、4肋間隙打開胸腔，用開胸器撐開切口，用眼科小鑷子輕夾心包膜，用眼科小剪子剪開心包膜，暴露心臟，用鑷子輕提左心耳，于左冠狀動脈前降支起源點2 mm處用6號縫線結扎冠狀動脈左前降支（假手術組只穿線不結扎）。心電圖示波器示，胸前導聯ST段顯著提高，T波高聳。重置心臟于胸腔，迅速分層縫合胸壁，于傷口處敷以青霉素鈉，并注射0.2 mL/kg呋噻米，0.2 mL/kg洛貝林。待動物恢復自主呼吸狀態且平穩后，停人工呼吸機。常規喂養1周。2）模型組、中成藥組、纈沙坦組的大鼠從術后第2周開始減食喂養，令其饑餓，每日讓其游泳1次至大鼠疲乏為止。繼續喂養至第8周。

氣虛血瘀型慢性心衰造模的診斷：1）氣虛血瘀證候診斷：除假手術組，其余各組造模成功后，常規喂養大鼠7周，經減食、力竭式游泳，大鼠表現主要為呼吸困難，多蜷縮，疲乏無力，精神萎靡，活動少，活動后明顯，嚴重的呈瘀斑、瘀點狀態，符合氣虛血瘀證標準。2）動物模型的疾病診斷：于手術5周后用L-400彩色超聲心動儀進行大鼠心功能檢測，以左室射血分數（Left Ventricular Ejection Fraction，LVEF）值小于60%作為心力衰竭模型成功的標志。

1.2.2 給藥方法 術后第9周，氣虛血瘀型慢性心衰大鼠造模成功后，模型組、中成藥組、纈沙坦組、假手術組，進行實驗用藥干預，具體如下：1）模型組：大鼠每天肌注生理鹽水1 mL，連續4周;2）中成藥：大鼠每天肌注黃芪注射液、丹參注射液各0.5 mL，連續4周;3）纈沙坦組：按20 mg/（kg·d）的劑量，灌胃，連續4周;4）假手術組：每天肌注生理鹽水1 mL，連續4周。

1.2.3 檢測指標與方法 完成4周給藥后將大鼠麻醉后予心臟解剖取其心肌組織，檢測各項指標，檢測方法如下：1）超聲心動圖檢查：使用Logiq9彩色超聲診斷儀，探頭頻率10 MHz。將大鼠麻醉后仰臥固定，獲取胸骨旁左心室長軸和乳頭肌水平短軸切面。檢測指標包括左室舒張末期內徑（Left Ventricular End Diastolic Diameter，LVDd）、左室收縮末期內徑（Left Ventricular End-systolic Dimension，LVDs）、左心室射血分數（Left Ventricular Ejection Fraction，LVEF），左心室縮短分數（Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS）。2）觀察指標氯化三苯四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TRC）染色法測定大鼠心肌梗死面積：頸動脈采血后，取出心臟，用濾紙吸干，稱重，放置-20 ℃冰箱，20 min后取出，將心肌均勻切成6～8片，每片厚約1 mm，放置1%TTC磷酸緩沖液中37 ℃水浴15 min左右。壞死區因、不染色，未壞死區染為紅色。標本在4%多聚甲醛中固定24 h后，在顯微鏡下觀察，用圖像分析軟件分別測定心肌缺血危險區面積和壞死區面積梗死面積大小用梗死區與危險區面積的比值表示。3）三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）、一磷酸腺苷（Adenosine Monophosphate，AMP）的測定：用高效液相法測定心肌組織ATP、ADP和AMP含量，稱取大鼠心肌組織100 mg加入0.42 mol/L高氯酸1 mL冰浴中，進行迅速勻漿，以離心半徑15 cm、15 000 r/min，離心12 min，取上清液200 μL加入1 mol/L的K2HPO4 200 μL，調pH至6.5，再次15 000 r/min低溫（4 ℃）離心10 min，取上清液100 μL過0.22 mm微孔濾膜待測。

1.3 統計學方法 采用PASW Statistics18.0統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料用均值±標準差（±s）表示，組間比較主要采用獨立樣本t檢驗。定性指標描述各類的例數及百分數，組間比較主要采用χ2檢驗（或確切概率法），等級資料采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色圖片-計算心室肌細胞橫截面積 模型組、纈沙坦組和中成藥組心室肌細胞橫截面積大于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;纈沙坦組和中成藥組心室肌細胞橫截面積小于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;中成藥組心室肌細胞橫截面積小于纈沙坦組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1～4和表1。

2.2 各組大鼠心功能指標變化比較 模型組、纈沙坦組和中成藥組LVEF和LVFS低于假手術組，而LVESD和LVEDD高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;纈沙坦組和中成藥組LVEF和LVFS高于模型組，而LVESD和LVED低于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;中成藥組LVEF和LVFS高于纈沙坦組，差異有統計學意義（P<0.05）;而中成藥組和纈沙坦組LVESD和LVED比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠心肌組織磷酸腺苷變化比較 各組AMP比較，差異無統計學意義（P>0.05）;模型組、纈沙坦組和中成藥組ATP和ADP低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;纈沙坦組和中成藥組ATP和ADP高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;中成藥組ATP和ADP高于纈沙坦組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

中醫學認為，“氣”是構成人體和維持生命活動的最基本物質，能夠看做機體各種生命活動的推動力[7-8]。有學者從生物能量角度觀察中醫“氣”的物質性，通過生物化學及分子生物學方面的研究，認為“氣”是人體活動的能量，氣虛與機體細胞ATP的生成和利用障礙有一定關系[9-11]。據現代醫學研究，補氣類中藥如黃芪、人參等，活血化瘀類中藥如丹參、三七等能干預心肌細胞的能量代謝，從而達到抗心力衰竭的作用。中藥黃芪，味甘，性微溫，為補氣良藥，黃芪注射液具有非洋地黃類正性肌力作用，黃芪甙Ⅳ是其正性肌力作用的主要活性成分，能抑制Na+-K+-ATP酶活性和抗氧自由基損傷。據臨床觀察，黃芪注射液可改善心力衰竭患者的左室構型和射血功能;穩定細胞膜，改善心肌營養和心肌細胞線粒體功能，達到心肌保護的作用[12-13]。丹參味苦，性微寒，具有活血化瘀，去瘀生新等功效。研究表明，丹參注射液作用于心腦血管方面的機理是：降低血粘度，抑制血小板黏附和聚集，從而改善微循環，防止動脈粥樣硬化和血栓的形成等[14-15]。因黃芪性溫向上，有益氣利水之功;丹參性涼，具活血化瘀之效。兩藥合用則升降相得，沉浮不過，溫涼相佐，不偏寒熱，共奏益氣、活血、利水之功。本文研究表明，纈沙坦組和中成藥組LVEF和LVFS高于模型組，而LVESD和LVED低于模型組，中成藥組LVEF和LVFS高于纈沙坦組，說明益氣化瘀法可改善大鼠心功能。

能量代謝包括能量的產生、儲存與轉化，與心力衰竭有關的能量代謝障礙主要發生在能量產生這一環節[16]。營養物質氧化磷酸化與無氧的糖酵解過程是心肌能量產生的2種主要途徑。90%的能量由前一種途徑產生。線粒體是細胞內氧化磷酸化及ATP形成的場所，其功能正常與否，直接影響能量代謝的順利進行[17]。心肌能量代謝中的高能磷酸化合物包括AMP、ADP、ATP等。心力衰竭時，線粒體對營養物質氧化磷酸化的調控能力明顯降低，導致呼吸鏈中高能磷酸化合物生成障礙[18-19]。研究顯示，心肌纖維與線粒體所含肌酸激酶活性在心力衰竭早期與中期較正常時明顯下降，使ADP短時間內合成減少，可能是心肌收縮功能在心力衰竭早、中期發生急劇失調的重要原因之一[20]。本文研究表明，纈沙坦組和中成藥組ATP和ADP高于模型組，且中成藥組ATP和ADP高于纈沙坦組，說明益氣化瘀法可改善大鼠能量代謝。

綜上所述，益氣化瘀法可明顯改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝，具有重要研究意義，值得研究。

參考文獻

[1]Ky B，French B，Mccloskey K，et al.High-sensitivity ST2 for prediction of adverse outcomes in chronic heart failure[J].Circulation Heart Failure，2016，4（2）：180-187.

[2]Testa G，Cacciatore F，Bianco A，et al.Chronic obstructive pulmonary disease and long-term mortality in elderly subjects with chronic heart failure[J].Aging Clinical & Experimental Research，2017，29（6）：1-8.

[3]Arzt M，Woehrle H，Oldenburg O，et al.Prevalence and Predictors of Sleep-Disordered Breathing in Patients With Stable Chronic Heart Failure：The SchlaHF Registry[J].Jacc Heart Failure，2016，4（2）：116-125.

[4]韋葭蔚，黃幸，趙慧輝，等.慢性心力衰竭中醫四診信息與患者生命質量的相關性[J].世界中醫藥，2018，13（3）：746-750.

[5]周少澎.歸脾湯治療氣虛血瘀型慢性充血性心力衰竭應用價值體會[J].中國實用醫藥，2019，14（7）：115-117.

[6]楊陽，楊寶元，張磊，等.益氣化瘀顆粒治療慢性舒張性心力衰竭60例臨床觀察[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14（3）：236-238.

[7]彭琴文.中醫治療慢性心力衰竭臨床研究進展[J].河北中醫，2016，38（9）：1432-1435.

[8]虞穎茜，方居正.中醫藥治療慢性心衰研究進展[J].中醫臨床研究，2016，8（24）：88-89.

[9]陳婕，王肖龍，阮小芬.中醫藥治療慢性心力衰竭的研究進展[J].陜西中醫，2016，37（6）：761-762.

[10]劉昌華.益氣化瘀顆粒治療慢性收縮性心力衰竭氣虛血瘀證100例臨床硏究[J].中醫臨床研究，2017，9（19）：59-61.

[11]黎桂泱.益氣化瘀湯輔助治療氣虛血瘀型慢性心力衰竭31例[J].浙江中醫雜志，2017，52（5）：337.

[12]孫金菊.黃芪注射液治療慢性心力衰竭臨床研究[J].新中醫，2016，13（2）：28-30.

[13]高軍華，千智斌.黃芪注射液預處理對大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].新鄉醫學院學報，2016，33（10）：856-859.

[14]汪奕忱，莊燕，顧陽，等.黃芪注射液聯合復方丹參注射液治療心力衰竭臨床療效Meta分析[J].中醫藥導報，2016，13（24）：62-68.

[15]霍新新，馬永強，劉霞，等.復方丹參滴丸對實驗性心肌肥厚大鼠心肌氧化應激指標和炎性因子的影響[J].新鄉醫學院學報，2018，35（8）：671-676.

[16]顏娟，鄭茂東，崔玉環，等.牡荊苷對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織能量代謝的影響[J].山東醫藥，2017，57（5）：26-29.

[17]唐斌，張金國，譚洪勇，等.黃芪甲苷對慢性心衰大鼠心肌纖維化及能量代謝的影響[J].中國病理生理雜志，2017，33（3）：411-416.

[18]楊順茂.磷酸肌酸鈉在急性心肌梗死介入術后心力衰竭治療中的應用[J].山東醫藥，2017，57（38）：60-62.

[19]張艷，劉秀娜，王懿，等.冠心舒通膠囊對慢性心力衰竭大鼠心肌能量代謝的影響[J].中醫雜志，2015，56（23）：2054-2057.

[20]潘瑞洋，孫家珍，趙奕霖，等.辛伐他汀對慢性心力衰竭兔人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和β-catenin表達的影響[J].新鄉醫學院學報，2017，34（12）：1048-1052.