miR-92a對宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡影響及其機(jī)制

王利娟　谷麗娟　孫穎川

[摘要]目的 探討miR-92a對宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及其機(jī)制。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測宮頸癌細(xì)胞系中miR-92a的表達(dá)情況。將細(xì)胞分為空白對照組（未轉(zhuǎn)染）、miR-92a抑制物陰性對照組（轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor NC）和miR-92a抑制物組（轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor），并以RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western blot檢測細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和生存素（Survivin）蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與正常上皮293T細(xì)胞相比，miR-92a在宮頸癌Hela、C33A和Caski細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯升高（t=6.446～14.544，P<0.001），其中以Hela細(xì)胞上升最為顯著。與空白對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor使Hela細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)、A值、MMP-2和Survivin蛋白表達(dá)均顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=3.479～22.18，P<0.05）;而轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor NC后差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論 miR-92a在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可以抑制細(xì)胞生長，其作用機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2和Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]宮頸腫瘤;微RNAs;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;基質(zhì)金屬蛋白酶2;凋亡調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)類

[中圖分類號]R737.33;R342.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號] 2096-5532（2019）04-0406-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of miR-92a on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cells and its mechanism. MethodsReverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to measure the expression of miR-92a in cervical cancer cell line. Cells untransfected， transfected with miR-92a inhibitor negative control， and transfected with miR-92a inhibitor were assigned to blank control group， miR-92a inhibitor negative control group， and miR-92a inhibitor group， respectively， and the transfection effect was evaluated by RT-PCR. MTT assay was used to evaluate cell proliferation， and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Western blot was used to measure the protein expression of matrix metalloproteinase （MMP）-2 and survivin in the cells. ResultsCompared with normal epithelial 293T cells， the Hela， C33A， and Caski cells of cervical cancer had significant increases in the expression level of miR-92a （t=6.446-14.544，P<0.001）， and the Hela cells had the greatest increase. Compared with the blank control group， the miR-92a inhibitor group had significant reductions in the expression of miR-92a， A value， MMP-2， and survivin protein in Hela cells， and a significant increase in cell apoptosis rate （t=3.479-22.18，P<0.05）; however， there were no significant differences in the above indices between the miR-92a inhibitor negative control group and the blank control group （P>0.05）. ConclusionmiR-92a is highly expressed in cervical cancer cells， and interfering with its expression can inhibit cell growth， possibly by down-regulating the expression of MMP-2 and survivin protein.

[KEY WORDS]uterine cervical neoplasms; microRNAs; cell proliferation; apoptosis; matrix metalloproteinase 2; apoptosis regulatory proteins

2015年數(shù)據(jù)顯示，全球?qū)m頸癌的新發(fā)病例和死亡數(shù)分別為52.76萬和26.57萬，而發(fā)展中國家是其高發(fā)區(qū)，且近年來有年輕化的趨勢[1]。MiR-92a作為微小核糖核酸（miRNAs）中的一員，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成密切相關(guān)[2]，且在胃癌、結(jié)直腸癌和肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等生理過程密切相關(guān)[3-5]。有研究指出miR-92a在宮頸癌病人血清中的表達(dá)明顯升高，且參與宮頸癌的增殖和侵襲[6-7]，但其在宮頸癌中的作用及其機(jī)制尚不完全明確。故本研究采用RNA干擾其表達(dá)，旨在進(jìn)一步闡明miR-92a對宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑

正常上皮293T細(xì)胞和宮頸癌Hela、C33A、Caski細(xì)胞均來自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。引物、miR-92a inhibitor和miR-92a inhibitor NC購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，生存素（Survivin）抗體、β肌動蛋白（β-actin）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG（HRP-IgG）二抗均購自美國Santa Cruz公司;蛋白提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC（Anne-xin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天公司，Trizol試劑和噻唑藍(lán)（MTT）試劑購自大連Takara公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和Lipofectamine 2000均購自美國Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取出保存的293T、Hela、C33A和Caski細(xì)胞株，于37 ℃的水浴鍋中解凍。解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有2 mL DMEM完全培養(yǎng)液的4個離心管中，離心棄培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。將4種細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至4個培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)液后置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃、飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將4種細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏确謩e接種到含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為70%時，加2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶2比例進(jìn)行傳代。

1.2.2miR-92a表達(dá)檢測收集上述4種細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，并以紫外線分光光度計(jì)檢測其濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共32個循環(huán);反應(yīng)體系為25 μL，其中正反引物各2 μL。以U6作內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算miR-92a的表達(dá)水平。每個樣品重復(fù)3次。所用引物及其序列見表1。

1.2.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以每孔2 mL（2×108/L）接種至96孔板上，將其分為空白對照組（A組）、miR-92a抑制物陰性對照組（B組）和miR-92a抑制物組（C組）。其中A組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染（只加入等量培養(yǎng)液稀釋的Lipfectamine 2000），B和C組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor NC和miR-92a inhibitor，按照Lipfecta-mine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，以1.2.2中的方法檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測收集上述轉(zhuǎn)染后48 h的各組Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后以每孔3×104個接種至培養(yǎng)板上，每組設(shè)5個復(fù)孔，在含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃、飽和濕度為95%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48、72和96 h后收集細(xì)胞，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37 ℃下反應(yīng)4 h后，棄上清，加200 μL二甲基亞砜，充分反應(yīng)后，使用酶標(biāo)儀（480 nm波長）檢測各組細(xì)胞的吸光度（A）。重復(fù)3次。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測分別取轉(zhuǎn)染后48 h的各組Hela細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化及PBS洗滌后，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，參照凋亡試劑盒說明書的步驟檢測各組細(xì)胞的凋亡率。重復(fù)3次。

1.2.6MMP-2和Survivin蛋白表達(dá)檢測取1.2.3中轉(zhuǎn)染后48 h的各組Hela細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法檢測其濃度。取50 μg蛋白樣品上樣到120 g/L的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。以封閉液封閉2 h后，加入1∶800稀釋的MMP-2抗體、Survivin抗體和β-actin抗體，于4 ℃下孵育過夜，再加入1∶1 000稀釋的二抗，37 ℃下處理1 h后，ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算MMP-2和Survivin蛋白的相對表達(dá)量。重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1miR-92a在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明，與正常上皮293T細(xì)胞中miR-92a相對表達(dá)量（1.05±0.06）相比，miR-92a在宮頸癌Hela（3.78±0.35）、C33A（2.69±0.18）和Caski（2.26±0.23）細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯升高（t=6.446～14.544，P<0.001），其中以Hela細(xì)胞上升最為顯著（F=72.327，P<0.001）。

2.2miR-92a對Hela細(xì)胞增殖的影響

RT-PCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor使miR-92a的表達(dá)水平（0.18±0.02）較對照組（0.99±0.06）下降了18.18%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.18，P<0.001）;而miR-92a抑制物陰性對照組（0.95±0.05）與空白對照組間miR-92a的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示抑制Hela細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)是有效的。MTT法檢測各組細(xì)胞的A值表明，與空白對照組相比，miR-92a抑制物組細(xì)胞的A值隨時間的延長均顯著降低（t=3.781～5.668，P<0.05），但miR-92a抑制物陰性對照組的A值變化不顯著（t=0.191～0.510，P>0.05）。提示抑制miR-92a表達(dá)可明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖（F=8.420～20.705，P<0.05）。見表2。

2.3miR-92a對Hela細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，與空白對照組的細(xì)胞凋亡率（6.22±1.03）%相比，轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor的細(xì)胞凋亡率（16.35±2.42）%顯著升高（t=7.766，P<0.05），而轉(zhuǎn)染miR-92a inhibitor NC的細(xì)胞凋亡率（7.11±0.86）%上升不明顯（t=0.682，P>0.05）。提示抑制miR-92a表達(dá)可誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。見圖1。

2.4miR-92a對MMP-2和Survivin蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測結(jié)果表明，MMP-2和Survivin在miR-92a抑制物組細(xì)胞中的表達(dá)較空白對照組均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.479～4.877，P<0.05），而MMP-2和Survivin在miR-92a抑制物陰性對照組中的表達(dá)與空白對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.316～0.610，P>0.05）。提示抑制miR-92a表達(dá)可以下調(diào)Hela細(xì)胞中MMP-2和Survivin蛋白的表達(dá)。見圖2、表3。

3討論

MiR-92a家族在血管形成、器官發(fā)育和腫瘤的進(jìn)展方面具有重要調(diào)控作用，成熟的miR-92a基因是由miR-92a～1和miR-92a～2生成，位于13q13染色體上[8-10]。大量研究顯示，miR-92a參與甲狀腺乳頭狀癌、膀胱癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-13]。SHARIFI等[14]發(fā)現(xiàn)，抑制miR-92a表達(dá)可通過調(diào)控p63誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。仲飛等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a反義寡核苷酸可抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。XIAO等[16]和趙靚等[17]在鼻咽癌及骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制miR-92a的表達(dá)可調(diào)控PTEN/Akt信號通路抑制癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a在宮頸癌中高表達(dá)，但其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少[6-7]。本研究RT-PCR檢測結(jié)果表明，miR-92a在宮頸癌Hela、C33A和Caski細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯升高，其中以Hela細(xì)胞上升最為顯著。脂質(zhì)體干擾Hela細(xì)胞中miR-92a的表達(dá)后，可明顯抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示miR-92a可能在宮頸癌中發(fā)揮著癌基因的作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可通過調(diào)控細(xì)胞周期參與成神經(jīng)管細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖過程[18]，也可以通過信號途徑參與肺腺癌細(xì)胞凋亡[19]。MMP-2是MMPs成員之一，可通過降解Ⅳ型膠原蛋白、調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和促進(jìn)新生血管形成等參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等過程[20-22]，干擾MMP-2表達(dá)可下調(diào)VEGF和上調(diào)Cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。Survivin是最強(qiáng)的凋亡抑制因子，通過調(diào)控半胱氨酸天冬酶和微管蛋白等參與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞的有絲分裂，在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、凋亡和血管形成等過程中發(fā)揮著重要的作用[24-25]。MMP-2和Survivin在宮頸癌中的陽性表達(dá)率均顯著高于正常宮頸組織，且與腫瘤的浸潤深度及惡性程度密切相關(guān)[26]。LIN等[27]在miR-92a促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲的研究中發(fā)現(xiàn)，anti-miR-92a能夠降低MMP-2活性。牛巍巍等[28]研究指出，miR-92a抑制物可通過下調(diào)Survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。為了探討miR-92a抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，本研究采用Western blot進(jìn)一步檢測Hela細(xì)胞中MMP-2和Survivin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Hela細(xì)胞中MMP-2和Survivin蛋白的表達(dá)水平均顯著下降，提示抑制miR-92a可能通過下調(diào)MMP-2和Survivin表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-92a在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，其作用機(jī)制可能為下調(diào)MMP-2和Survivin表達(dá)。

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（本文編輯于國藝）