他汀類(lèi)藥物對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及Akt蛋白表達(dá)影響

侯廣杰　何苡　楊光煜

[摘要] 目的 探討他汀類(lèi)藥物對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及蛋白激酶B（Akt）蛋白表達(dá)影響。方法 取食管鱗癌（ESCC）細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，以不同時(shí)間（24、48 h）和不同濃度（15、45 μmol/L）的普伐他汀、辛伐他汀進(jìn)行干預(yù)（4個(gè)實(shí)驗(yàn)組），并設(shè)立空白對(duì)照組。分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和丙二醛（MDA）含量，以及辛伐他汀對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡、Akt mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 普伐他汀、15 μmol/L辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖均無(wú)明顯影響（P>0.05），45 μmol/L辛伐他汀能夠顯著抑制癌細(xì)胞增殖（F=5.345、16.383，P<0.05）。各濃度普伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，MDA含量均無(wú)明顯變化（P>0.05）;各濃度辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，MDA含量均有明顯上升（F=5.913、7.435，P<0.05）。辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，G0/G1期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，S期、G2/M期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組（t=2.975～10.027，P<0.05）。各濃度辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，Akt mRNA表達(dá)均明顯下降（F=6.541、7.548，P<0.05）。結(jié)論 辛伐他汀對(duì)食管癌細(xì)胞確有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，并能夠抑制Akt蛋白的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 食管腫瘤;普伐他丁;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;癌基因蛋白質(zhì)v-Akt

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.1;R972.6 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] ?2096-5532（2019）04-0434-04

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of statins on the proliferation of esophageal cancer cells and the expression of protein kinase B （Akt）. ?Methods An esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） cell line was cultured， and the cells were divided into 4 experimental groups and were treated with pravastatin or simvastatin at different concentrations （15 and 45 μmol/L）. A blank control group was also set up. Cell proliferation and malondialdehyde （MDA） level were measured for all groups， and the effect of simvastatin on cell cycle， cell apoptosis， and mRNA expression of Akt was analyzed. ?Results Pravastatin and 15 μmol/L simvastatin had no significant effect on the proliferation of ESCC cells （P>0.05）， and 45 μmol/L simvastatin significantly in-hibited the proliferation of cancer cells （F=5.345 and 16.383，P<0.05）. The cancer cells treated with different concentrations of pravastatin had no significant change in MDA content （P>0.05）， while those treated with different concentrations of simvastatin had a significant increase in MDA content （F=5.913 and 7.435，P<0.05）. When the cancer cells were treated with simvastatin， compared with the control group， the experimental group had a significantly higher number of cells in the G0/G1 phase and a signi-ficantly lower number of cells in the S phase or G2/M phase （t=2.975-10.027，P<0.05）. The cancer cells treated with different concentrations of simvastatin had a significant reduction in the mRNA expression of Akt （F=6.541 and 7.548，P<0.05）. ?Conclusion Simvastatin can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of esophageal cancer cells and inhibit the expression of Akt protein.

[KEY WORDS] esophageal neoplasms; pravastatin; cell proliferation; apoptosis; oncogene protein v-Akt

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，每年全球約有30萬(wàn)人死于此病[1]。近年有多項(xiàng)研究表明，他汀類(lèi)藥物在抑制包括肺癌、肝癌、乳癌等多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面有效而且安全，可使癌癥風(fēng)險(xiǎn)率降低20%～30%，但對(duì)于食管癌方面的研究則少見(jiàn)報(bào)道[2-4]。因此，本文采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方式，培養(yǎng)食管鱗癌（ESCC）細(xì)胞株并采用他汀類(lèi)藥物進(jìn)行干預(yù)，取其親水型代表普伐他汀和親脂型代表辛伐他汀做對(duì)照研究，探討他汀類(lèi)藥物對(duì)食管癌細(xì)胞增殖及蛋白激酶B （Akt）蛋白表達(dá)影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人類(lèi)ESCC細(xì)胞株DC875（上海澤葉生物科技有限公司，來(lái)源庫(kù)：ATCC）;辛伐他汀（CAS 79902-63-9，上海士鋒生物科技有限公司）;普伐他?。–AS 81131-70-6，上海譜振生物科技有限公司）。CCK-8試劑及試劑盒（同仁化學(xué)研究所，日本）;FACS Calibur流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，USA）;丙二醛 （MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑和試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) EAC細(xì)胞株和ESCC細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞樣本根據(jù)干預(yù)時(shí)間設(shè)立24、48 h干預(yù)培養(yǎng)板。各板樣本再根據(jù)采用普伐他汀、辛伐他汀干預(yù)分為兩組，每組內(nèi)設(shè)15、45 μmol/L兩種濃度，包括15 μmol/L普伐他汀組（B組）、45 μmol/L普伐他汀組（C組）、15 μmol/L辛伐他汀組（D組）、45 μmol/L辛伐他?。‥組），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（對(duì)照組，A組），每組含兩個(gè)復(fù)孔。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，統(tǒng)計(jì)增殖平均值。

1.2.3 MDA檢測(cè) 按照MDA試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，記錄吸光度值。同時(shí)，采用BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）測(cè)定樣本蛋白濃度。

1.2.4 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采集45 μmol/L濃度辛伐他汀處理的細(xì)胞樣本液，使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率。

1.2.5 Akt mRNA檢測(cè) 取對(duì)照組及45 μmol/L辛伐他汀藥物處理24、48 h的細(xì)胞樣本液，采用熒光定量PCR對(duì)Akt基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

本研究評(píng)價(jià)的指標(biāo)包括：①細(xì)胞增殖吸光度變化;②MDA含量[5-6]; ③細(xì)胞周期各期的占比以及凋亡率;④Akt mRNA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用2×2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，比較不同他汀類(lèi)藥物濃度和作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖的影響及交互作用;采用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析，比較他汀類(lèi)藥物對(duì)MDA含量的影響，以及辛伐他汀對(duì)Akt mRNA含量的影響及交互作用;采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較辛伐他汀對(duì)細(xì)胞周期及凋亡率的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) ?果

2.1 他汀類(lèi)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組相比較，在15 μmol/L普伐他汀和辛伐他汀、45 μmol/L普伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，均對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響（P>0.05）;而辛伐他汀在45 μmol/L濃度時(shí)，能夠顯著抑制癌細(xì)胞增殖（F=5.345、16.383，P<0.05）。析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，不同藥物有交互作用（F藥物=9.435，P<0.05），不同濃度有交互作用（F濃度=6.674，P<0.05），不同時(shí)間有交互作用（F時(shí)間=4.687，P<0.05），濃度與時(shí)間沒(méi)有交互作用（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 他汀類(lèi)藥物對(duì)MDA含量的影響

A～E組MDA含量分別為1.73±0.16、1.75±0.21、1.74±0.18、2.63±0.36、7.61±1.15。與空白對(duì)照組相比，各濃度普伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，MDA含量均無(wú)明顯變化（P>0.05）;各濃度辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，MDA含量均有明顯上升（F=5.913、7.435，P<0.05）。析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，不同藥物有交互作用（F藥物=4.687，P<0.05），不同濃度有交互作用（F濃度=7.635，P<0.05），濃度與時(shí)間沒(méi)有交互作用（P>0.05）。

2.3 辛伐他汀對(duì)細(xì)胞周期及凋亡率的影響

與對(duì)照組相比，45 μmol/L辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，G0/G1期實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，S期、G2/M期實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組（t=2.975～10.027，P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（t=14.278，P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 辛伐他汀對(duì)Akt mRNA表達(dá)的影響

15 μmol/L辛伐他汀干預(yù)24、48 h細(xì)胞的Akt mRNA含量分別為74.32±8.21、63.47±7.13，45 μmol/L辛伐他汀干預(yù)24、48 h分別為60.15±7.43、27.43±2.98。各濃度辛伐他汀在干預(yù)癌細(xì)胞不同時(shí)間時(shí)，Akt mRNA含量均有明顯下降（F=6.541、7.548，P<0.05）。析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，不同時(shí)間有交互作用（F時(shí)間=5.617，P<0.05），不同濃度有交互作用（F濃度=5.617，P<0.05），濃度與時(shí)間有交互作用（F時(shí)間╳濃度=1.056，P<0.05）。

3 討 ?論

他汀類(lèi)藥物屬于HMG-CoA還原酶抑制劑，除了能夠強(qiáng)效地降低總膽固醇和低密度脂蛋白（LDL）?以外，還能夠在一定程度上提升高密度脂蛋白的水平[7-9]。國(guó)內(nèi)有研究顯示，他汀類(lèi)藥物對(duì)白血病細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，可以降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力，其機(jī)制可能與Akt蛋白信號(hào)通路有關(guān)[10]。Akt是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K通路的下游信號(hào)分子，而PI3K通路在體內(nèi)負(fù)責(zé)多種細(xì)胞的增殖代謝，其可以抵抗細(xì)胞凋亡，在癌細(xì)胞的增殖中起重要作用[11-13]。本文選取他汀類(lèi)藥物親水型代表普伐他汀和親脂型代表辛伐他汀作為干預(yù)藥物，觀察其對(duì)于ESCC細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響并探討其機(jī)制。

本文研究結(jié)果顯示，辛伐他汀只有在高濃度下（45 μmol/L）對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制較為明顯。這提示我們辛伐他汀對(duì)于食管癌細(xì)胞的增殖抑制存在濃度依賴(lài)性，而親水型的普伐他汀對(duì)細(xì)胞增殖則無(wú)明顯的抑制作用[14-17]。一項(xiàng)關(guān)于癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究顯示，親脂型的辛伐他汀在一定濃度基礎(chǔ)上可發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，而普伐他汀則無(wú)明顯影響[18]。其機(jī)制可能與其通過(guò)細(xì)胞膜的方式有關(guān)，親水性的藥物分子更難透過(guò)磷脂雙分子層到達(dá)細(xì)胞核[19-21]。但與臨床試驗(yàn)不同，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)并不能完全模擬人體通過(guò)正常代謝途徑后對(duì)藥物滲透性產(chǎn)生的額外作用。因此，尚不能斷言親水型的普伐他汀對(duì)于人體的食管癌細(xì)胞的增殖無(wú)作用[22]。另外，本文結(jié)合文獻(xiàn)分析，親水型的他汀類(lèi)藥物不能發(fā)揮作用可能與食管癌細(xì)胞表面缺乏相應(yīng)的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)縮氨酸（OATP1B1）通道有關(guān)，后期通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)食管癌細(xì)胞上的OATP1B1通道分布情況，該檢測(cè)可以作為證明親水型他汀類(lèi)藥物不能發(fā)揮相應(yīng)作用的可靠方法[24]。

由于對(duì)細(xì)胞代謝的分子難以逐個(gè)分析，故本文選取MDA作為細(xì)胞氧化損傷的代表指標(biāo)[23-25]，檢測(cè)其細(xì)胞生物學(xué)功能。結(jié)果表明，各濃度辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)，MDA含量均有明顯上升。提示辛伐他汀干預(yù)后癌細(xì)胞出現(xiàn)了過(guò)氧化損傷，且呈濃度依賴(lài)性。結(jié)合之前細(xì)胞增殖的結(jié)果，可以認(rèn)為普伐他汀并未真正進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用[26]。同時(shí)，推測(cè)過(guò)氧化殺傷是抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。本文辛伐他汀干預(yù)對(duì)細(xì)胞周期影響的結(jié)果顯示，ESCC細(xì)胞阻滯于G0/G1期，與國(guó)外的研究結(jié)果相符[27]。

Akt蛋白通路在腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡方面起到重要作用。對(duì)于一些研究顯示他汀類(lèi)藥物可調(diào)節(jié)通路Akt蛋白的表達(dá)[28]，本文也進(jìn)行了論證。結(jié)果表明，不同濃度和不同時(shí)間辛伐他汀干預(yù)癌細(xì)胞時(shí)Akt mRNA含量均明顯下降，且呈濃度依賴(lài)性。顯示了他汀類(lèi)藥物在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡方面的新研究方向。然而，關(guān)于他汀類(lèi)藥物的副作用以及對(duì)于食管癌預(yù)后是否存在負(fù)面影響，則需要進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)。

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（本文編輯 于國(guó)藝）