EGF-CP-HA水凝膠對大鼠皮膚創面愈合的影響

程連強　施春英　郭恩慧　邱魯陽　夏玉軍

[摘要] 目的 通過膠原蛋白肽-透明質酸負載表皮生長因子（EGF-CP-HA）水凝膠在大鼠全層皮膚缺損傷口的應用來探討其對皮膚傷口愈合的影響。方法 90只SD大鼠，麻醉后制備傷口創面動物模型，隨機分為生理鹽水（NS）組、透明質酸（HA）水凝膠組、膠原蛋白肽-透明質酸（CP-HA）水凝膠組、透明質酸負載表皮生長因子（EGF-HA）水凝膠組和EGF-CP-HA水凝膠組，每組18只。后4組大鼠在其皮膚傷口處分別貼敷相應水凝膠治療。觀察并記錄創面愈合情況。分別在相應時間點麻醉大鼠后取傷口及其周緣1 cm的組織，行蘇木精-伊紅、Masson、免疫組化染色來觀察損傷區域不同時間的組織病理變化、膠原纖維分布、血管內皮生長因子-α（VEGF-α）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達。結果 EGF-CP-HA水凝膠組大鼠皮膚傷口愈合時間最短（F=6.46，P<0.01）。蘇木精-伊紅染色顯示，EGF-CP-HA水凝膠組創面炎性反應較NS組輕，毛細血管及膠原纖維生成較其他組多;Masson染色顯示，EGF-CP-HA水凝膠組膠原纖維較其他組多，排列規則、有序，更接近正常皮膚;免疫組化染色顯示，EGF-CP-HA水凝膠組TGF-β1和VEGF-α的表達強度均顯著高于NS組（F=12.51～18.64，P<0.05）。結論EGF-CP-HA水凝膠可減輕皮膚創面的炎癥反應，提高VEGF-α和TGF-β1的表達水平，明顯促進傷口愈合。

[關鍵詞] 水凝膠類;透明質酸;表皮生長因子;膠原;傷口愈合;皮膚;大鼠

[中圖分類號] R977.6;R944.15 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] ?2096-5532（2019）04-0451-05

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of collagen peptide-hyaluronic acid loaded epidermal growth factor （EGF-CP-HA） hydrogel on skin wound healing in rats with full-thickness skin defect. ?Methods Ninety Sprague-Dawley rats were randomly divided into saline （NS） group， hyaluronic acid （HA） hydrogel group， collagen peptide-hyaluronic acid （CP-HA） hydrogel， hyaluronic acid-loaded epidermal growth factor hydrogel （EGF-HA） group， and EGF-CP-HA hydrogel group， with 18 rats in each group. The rats in the latter four groups were treated with corresponding hydrogels on their skin wounds. Wound healing was observed and recorded. After the rats were anesthetized at the corresponding time point， tissue samples at the wound and 1 cm from the wound were taken and subjected to hematoxylin-eosin， Masson， and immunohistochemical staining to observe the histopathological changes， the distribution of collagen fibers， and the expression of vascular endothelial growth factor-α （VEGF-α） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in the injured area at different time points. ?Results The wound healing time of rats in EGF-CP-HA hydrogel group was the shortest （F=6.46，P<0.01）. Hematoxylin-eosin staining showed that the EGF-CP-HA hydrogel group had milder inflammatory reaction of wound surface than the NS group， and had more formation of capillaries and collagen fibers than other groups; Masson staining showed that collagen fibers were more regularly arranged and closer to normal skin in the EGF-CP-HA hydrogel group than in other groups. Immunohistochemical staining showed that the expression of TGF-β1 and VEGF-α was significantly higher in the EGF-CP-HA hydrogel group than in the NS group （F=12.51-18.64，P<0.05）. ?Conclusion EGF-CP-HA hydrogel can alleviate the inflammatory reaction of skin wounds， increase the expression levels of VEGF-α and TGF-β1， and significantly promote wound healing.

[KEY WORDS] hydrogels; hyaluronic acid; epidermal growth factor; collagen; wound healing; skin; rats

皮膚是身體的第一道防線，大多數的皮膚輕微損傷可以自我修復，當皮膚損傷嚴重時，不能完全再生，創面形成瘢痕甚至延遲愈合或者不愈合。大面積或深層的皮膚損傷嚴重威脅人類健康，因此促進傷口愈合和減少瘢痕形成顯得尤為重要[1]。皮膚損傷后的愈合過程是一個由多種組織細胞、細胞因子、炎性細胞等共同參與且互相作用的極其復雜的生物學過程[2-3]。水凝膠是由親水性聚合物交聯而成的三維網狀結構，能夠承載細胞，并依靠其各種理化生物特性為處于其中的細胞營造微環境，從而促進傷口愈合。本研究根據透明質酸（HA）和膠原蛋白肽（CP）的理化性質，用丙烯酸酐加成的方法對狹鱈魚皮CP-HA進行處理制成負載重組人表皮生長因子（EGF）的水凝膠材料，將其貼敷于模型大鼠皮膚創面，觀察水凝膠對傷口愈合及瘢痕形成的影響，以探索一種使用安全、成本低廉的促進傷口愈合及減少瘢痕形成的組織工程材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生60 d左右的清潔級雄性SD大鼠90只，體質量220～250 g，購于青島大任富城畜牧有限公司。大鼠單籠飼養，環境溫度15～22 ℃、濕度50%～60%，實驗前適應環境飼養1周。

1.1.2 主要試劑 狹鱈魚皮CP粉由青島福生食品公司和青島大學醫學院饋贈;HA粉末、透析袋購自北京索萊寶科技有限公司;MTT、甲基丙烯酸酐（MA）、三乙胺、N-二甲基甲酰胺（DMF）、光引發劑I2959均購自美國Sigma-aldrich公司;兔抗血管內皮生長因子-α（VEGF-α）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）單克隆抗體購自英國Abcam公司，山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 CPMA和HAMA的合成

①CPMA的合成：將4 g CP粉加入到100 mL蒸餾水中，攪拌至充分溶解，將溶液的pH值調至7.4。加入30 mL的DMF，溶解后再加入4 g三乙胺攪拌至充分溶解，再加入10 mL的MA，在持續攪拌中反應48 h，并在反應過程中加入0.5 g碳酸氫鈉，最后調節pH值至7.4。反應結束后的溶液用截留分子量為1 000的透析袋透析3 d，然后用真空冷凍干燥機凍干后儲存備用。②HAMA的合成：將4 g的HA粉末加入到100 mL蒸餾水中，其余操作步驟同CPMA的合成。

1.3 水凝膠的制備

①HA水凝膠：在無菌的條件下應用PBS將HAMA配制成濃度為10 g/L的溶液。②CP-HA水凝膠：應用PBS配制成CPMA濃度為30 g/L和HAMA濃度為10 g/L的溶液。③EGF-HA水凝膠：在濃度為10 g/L的HAMA溶液中加入終濃度為1 mg/L重組人EGF。④EGF-CP-HA水凝膠：用PBS配制成CPMA濃度為30 g/L和HAMA濃度為10 g/L的溶液，加入終濃度為1 mg/L的重組人EGF。在以上4種溶液中分別加入終濃度為1 g/L的光引發劑I2959，充分混勻后，加入到模具中，用365 nm波長紫外線照射15 min，待其形成固體的水凝膠后取出備用。整個操作過程均在無菌環境下進行。

1.4 動物模型的制備及分組

用手術切割方法造模，在造模前2 d于大鼠背部脊柱兩側用80 g/L硫化鈉脫毛備皮。術前腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，取俯臥位暴露大鼠背部，鋪無菌巾，術區常規用碘附消毒后，在距脊柱正中兩側旁開1 cm處用直徑1.2 cm的角膜環鉆做全層皮膚缺損創面，左右各1個，止血并用生理鹽水沖洗傷口，消毒后備用。將90只SD大鼠，隨機分為NS組（A組）、HA水凝膠組（B組）、EGF-HA水凝膠組（C組）、CP-HA水凝膠組（D組）和EGF-CP-HA水凝膠組（E組），每組18只。后4組大鼠在傷口處貼敷相應水凝膠治療，然后在傷口周緣縫合包扎涂抹凡士林的無菌紗布，遮蓋水凝膠及傷口，防止水凝膠脫落和傷口感染。

1.5 創面愈合情況觀察及實驗樣本采集

從造模當天（第0天）開始，每隔3 d使用佳能70D相機拍照，觀察創面愈合情況。用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量傷口面積，計算傷口創面愈合率。傷口創面愈合率=（建模后傷口面積-現在剩余傷口面積）/建模后傷口面積×100%。以傷口創面愈合率>90%為愈合標準。分別于第3、7、11、14、21、28天每組隨機選取3只大鼠，麻醉后取傷口及其周緣1 cm的包含皮膚和皮下組織的標本，用40 g/L多聚甲醛溶液固定。

1.6 組織學觀察

將組織標本常規脫水后進行石蠟包埋，制成5 μm厚的組織切片。根據標準流程進行常規蘇木精-伊紅染色、Masson三色染色，光鏡下觀察。

1.7 免疫組化染色

將石蠟切片常規脫蠟至水;加入檸檬酸鈉溶液在微波爐中進行抗原修復;以PBS漂洗3次，每次5 min;用內源性過氧化酶封閉液（體積分數0.03 H2O2）37 ℃封閉10 min;室溫下以PBS漂洗3次，每次5 min;用體積分數為0.10的山羊血清封閉10 min;分別滴加兔抗VEGF-α單克隆抗體（稀釋度1∶80）和兔抗TGF-β1單克隆抗體（稀釋度1∶100），4 ℃過夜;以PBS漂洗3次，每次5 min;加山羊抗兔二抗室溫孵育1 h;以PBS洗3次，每次5 min;加入二氨基苯乙胺在光學顯微鏡下控制顯色，用自來水沖洗終止顯色;蘇木精復染，脫水，中性樹膠封片。以棕黃色深染為免疫組化染色陽性，應用OLYMPUS光學顯微鏡采集圖片，用ipp 6.0軟件進行半定量分析。

1.8 統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析，計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素和重復測量設計方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 ?果

2.1 創面愈合時間和愈合率

EGF-CP-HA組創面愈合時間明顯短于NS組，差異有統計學意義（F=6.46，P<0.01）。時間與貼敷水凝膠無交互作用（F=2.19，P>0.05）。與NS組相比，應用水凝膠各組術后第3、7、11天的創面面積均有不同程度減小，以EGF-CP-HA組減小最明顯。EGF-CP-HA組術后第3、7、11天的創面愈合率與NS組相比較差異具有統計學意義（F=26.48～56.31，P<0.01）。見表1。

2.2 傷口創面的形態學變化

術后第3天，各組創面滲出液明顯減少，創面均被血痂皮覆蓋，傷口開始收縮變小，傷口周圍干燥，腫脹減輕。隨著時間的延長，應用水凝膠各組傷口創面減小的速度明顯快于NS組，其中以EGF-CP-HA組促進傷口愈合的效果最明顯。術后第12天，EGF-CP-HA組傷口達到愈合標準，其余組未達到愈合標準。術后第28天，各組創面均已愈合，EGF-CP-HA組創面與周邊皮膚差別不明顯，無明顯瘢痕凸起，傷口愈合區域有大量新生毛發;其他組傷口周緣清晰，可見瘢痕組織形成，無明顯毛發生長。

2.3 組織學觀察

蘇木精-伊紅染色顯示，術后第3天，各組創面均有大量的肉芽組織形成并向傷口內生長，創面區域可見大量的毛細血管生成，大量的巨噬細胞和中性粒細胞浸潤，膠原纖維生成，但尚無完整表皮覆蓋創面，EGF-CP-HA組炎性反應較其他組輕，毛細血管及膠原纖維生成較其他組多。術后第14天，HA水凝膠組、EGF-HA水凝膠組和CP-HA水凝膠組創面炎性細胞浸潤較NS組減少，膠原纖維相對雜亂，肉芽組織向瘢痕組織轉變，而EGF-CP-HA組創面有完整的表皮覆蓋創面，創面有少量炎性細胞，膠原纖維排列更加整齊、規則。術后第21天，各組均有完整的表皮覆蓋創面，增厚的再生表皮與真皮層之間有明顯的界限，膠原纖維較之前排列整齊，炎癥細胞浸潤不明顯，未見明顯新生皮脂腺形成;與其他組相比，EGF-CP-HA組創面再生表皮形態更接近正常的表皮，有新生的毛囊形成，但其數量和密度較正常皮膚低。

Masson三色染色將結締組織和膠原纖維染成藍色，平滑肌染成紅色，細胞核染成褐色。術后第3、14、21天，各組均有膠原纖維在組織中生成;術后第14、21天，EGF-CP-HA組膠原纖維數量最多，對照組最少;術后第21天，EGF-CP-HA組膠原纖維數量較其他組多，排列規則、有序，更接近正常皮膚。

2.4 創面組織TGF-β1和VEGF-α的表達

術后第3、7、11天，各組大鼠皮膚創面組織中TGF-β1和VEGF-α的表達比較，差異均有統計學意義，以EGF-CP-HA組的表達最多，NS組的表達最少（F=12.51～18.64，P<0.05）。見表2。

2.5 新生血管數

取術后第11天的組織切片，應用VEGF-α免疫組化染色法標記毛細血管，結果顯示，NS組、HA水凝膠組、EGF-HA水凝膠組、CP-HA水凝膠組和EGF-CP-HA水凝膠組大鼠的毛細血管數分別為6.51±1.29、7.75±0.96、8.52±1.00、9.50±1.29和11.53±1.29（n=6），與NS組相比，應用水凝膠各組新生血管數均有增加，以EGF-CP-HA組增加最明顯，差異具有統計學意義（F=6.53，P<0.01）。

3 討 ?論

傷口創面愈合是一個由多種細胞和組織成分參與的高度復雜、協同的過程，包括各種組織的再生、肉芽組織增生和瘢痕組織形成等，可分為急性炎癥期、炎癥反應期、組織增生期和組織重塑期等4個主要階段[4-6]，但4個階段無明顯界限、互相重疊。參與創面修復的細胞包括巨噬細胞、中性粒細胞、血小板、血管內皮細胞、表皮角質形成細胞、真皮成纖維細胞、外根鞘細胞、神經細胞及脂肪細胞等[7-8]。這些細胞所釋放出來的各種細胞因子和生長因子直接參與了創面修復的各個階段[9-11]。

在全層皮膚傷口中，基底膜破裂，皮膚附屬器官（皮脂腺、汗腺和毛囊等）被破壞。創面愈合時，上皮細胞遷移至傷口邊緣，肉芽組織填充創面床，此時成纖維細胞迅速浸潤皮膚傷口，成纖維細胞的浸潤對于誘導早期炎癥反應以促進皮膚傷口再上皮化非常重要[12]。炎癥過程與創面愈合直接相關，炎癥細胞因子刺激創面再上皮化，促進創面愈合[13]。EGF可通過促進內皮細胞和成纖維細胞的增殖，加速包括皮膚在內的各種組織的傷口再生[14]。實驗已證明，水凝膠負載重組人EGF的濃度為1 mg/L時最有利于皮膚傷口的恢復[15]。通過在CP-HA水凝膠中培養人臍帶間充質干細胞實驗，目前可以大致認為CPMA濃度為30 g/L、HAMA濃度為10 g/L是一個較為適宜的制備凝膠濃度[16]。

本文創面愈合時間結果顯示，應用水凝膠各組均可以不同程度加快創面愈合，以EGF-CP-HA組效果最明顯。考慮原因可能為：EGF-CP-HA水凝膠能為創面保濕，在創面上形成保護層，防止皮膚缺損部位與外界的大面積接觸，減少創面感染的概率，為創面愈合創造更好的條件;EGF-CP-HA水凝膠可以持續緩慢釋放重組人EGF，其中的HA在組織生長、發育、傷口愈合和消除炎癥等方面有巨大作用，且狹鱈魚皮CP具有良好的生物相容性，可通過促進成纖維細胞增殖、蛋白合成，提高M2型巨噬細胞含量，促進大鼠傷口的愈合[17]。

VEGF又稱為血管通透因子，是一種誘導血管生成的多功能生長因子。它能特異性地促進血管內皮細胞分裂、增殖，增強血管通透性以及誘導血管生成等，而VEGF-α是目前已知的促進血管生成效果最顯著的因子[18]。本實驗結果顯示，VEGF-α在大鼠皮膚創面及其周緣的中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、皮脂腺上皮細胞、毛囊中均有表達，但以在成纖維細胞中的表達為主，與NS組相比較，應用水凝膠各組VEGF-α的表達量均明顯增加，且以EGF-CP-HA組的表達量最高。CORRAL等[19]的研究結果顯示，損傷后的皮膚中VEGF mRNA的表達量可提高6～7倍，提出VEGF在皮膚創傷修復過程中的作用重大。

TGF-β1是已知的效果最顯著的促纖維化因子，在傷口創面愈合整個過程中起著非常重要的作用，它不僅可促進成纖維細胞快速增殖，而且能夠促進多種細胞分泌膠原、HA等細胞外基質成分，從而促進肉芽組織的形成、肌成纖維細胞轉化及再上皮化[20]。本實驗中，術后第3、7、11天，應用水凝膠各組大鼠皮膚創面組織中TGF-β1的表達均較NS組顯著增高，且以EGF-CP-HA組的表達量最高，表明外源性應用重組人EGF能夠提高創面周緣部位TGF-β1的分泌[20]，進而協同其他生長因子促進膠原的產生，減輕炎癥反應，促進組織修復，最終加速傷口創面的愈合。

膠原蛋白作為一種重要的生物材料，已廣泛應用于化妝品和醫用生物材料領域。水產膠原蛋白沒有口蹄疫、瘋牛病等傳染性疾病的病原，具有良好的生物相容性、無毒性、低抗原性和良好的生物降解性[21]。狹鱈魚皮含有大量的膠原纖維，其中主要為Ⅰ型膠原，并含有特定的抗凍蛋白，可以作為生產較好膠原蛋白的原料。CP用于創面可以與血液中的血小板接觸發生生化反應，產生血纖維，堵住傷口，減少出血;可以提高血紅蛋白含量、紅細胞數、紅細胞體積和血小板數;還能刺激細胞分裂增殖、分化，促進傷口愈合。因此，狹鱈魚皮是較好的膠原蛋白醫用生物材料的來源。

綜上所述，本研究將狹鱈魚皮CP和HA通過丙烯酸酐接枝處理后，加入重組人EGF，在溫和的條件下交聯成凝膠，并將其覆蓋于大鼠全層皮膚缺損創面，結果顯示，該水凝膠能通過促進成纖維細胞增殖以及膠原蛋白、VEGF-α、TGF-β1的表達，對傷口愈合起到促進作用，并減少瘢痕形成，其臨床應用價值值得進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] LEE J E， KIM K E， KWON I C， et al. Effects of the controlled-released TGF-beta 1 from chitosan microspheres on chondrocytes cultured in a collagen/chitosan/glycosaminoglycan scaffold[J]. Biomaterials， 2004，25（18）：4163-4173.

[2] MARTIN J M， ZENILMAN J M， LAZARUS G S. Molecular microbiology： new dimensions for cutaneous biology and wound healing[J]. The Journal of Investigative Dermatology， 2010，130（1）：38-48.

[3] 薛亮，劉旭盛. 巨噬細胞在創面愈合中的作用研究進展[J]. 中華燒傷雜志， 2013，29（1）：62-64.

[4] BASSON M D. Hierarchies of healing in gut mucosal injury[J]. Journal of Physiology and Pharmacology， 2017，68（6）：789-795.

[5] KIM D J， MUSTOE T， CLARK R A. Cutaneous wound hea-ling in aging small mammals：a systematic review[J]. Wound Repair and Regeneration， 2015，23（3）：318-339.

[6] LOU Zhewei， ZHANG Chi， GONG Ting， et al. Wound-hea-ling effects of 635-nm low-level laser therapy on primary human vocal fold epithelial cells：an in vitro study[J]. Lasers in Medical Science， 2019，34（3）：547-554.

[7] KONDO T， ISHIDA Y. Molecular pathology of wound healing[J]. Forensic Science International， 2010，203（1/3）：93-98.

[8] LEE K B， CHOI J， CHO S B， et al. Topical embryonic stem cells enhance wound healing in diabetic rats[J]. Journal of Orthopaedic Research， 2011，29（10）：1554-1562.

[9] ORYAN A， ALEMZADEH E， MOSHIRI A. Burn wound healing：present concepts， treatment strategies and future directions[J]. Journal of Wound Care， 2017，26（1）：5-19.

[10] SALIBIAN A A， DEL ROSARIO A T， MOURA SEVERO L D， et al. Current concepts on burn wound conversion-A review of recent advances in understanding the secondary progressions of burns[J]. Burns， 2016，42（5）：1025-1035.

[11] SHUPP J， NASABZADEH T， ROSENTHAL D， et al. A review of the local pathophysiologic bases of burn wound progression[J]. Journal of Burn Care & Research， 2010，31（6）：849-873.

[12] PASTORE S， MASCIA F， MARIANI V A. The epidermal growth factor receptor system in skin repair and inflammation[J]. Journal of Investigative Dermatology， 2008，128（6）：1365-1374.

[13] KIMURA A， TERAO M， KATO A， et al. Upregulation of N-acetylglucosaminyltransferase-Ⅴ by heparin-binding EGF-like growth factor induces keratinocyte proliferation and epidermal hyperplasia[J]. Experimental Dermatology， 2012，21（7）：515-519.

[14] DEGIM Z， CELEBI N， ALEMDAROGLU C， et al. Evaluation of chitosan gel containing liposome-loaded epidermal growth factor on burn wound healing[J]. International Wound Journal， 2011，8（4）：343-354.

[15] WU Zhengzheng， TANG Yan， FANG Hongdou， et al. Decellularized scaffolds containing hyaluronic acid and EGF for promoting the recovery of skin wounds[J]. Journal of Materials Science. Materials in Medicine， 2015，26（1）：5322.

[16] 魏志君，施春英，程連強，等. 魚膠原蛋白肽-透明質酸水凝膠制備及其生物相容性[J]. 青島大學醫學院學報， 2017，53（5）：600-603，605.

[17] CASTILLO-BRICENO P， BIHAN D， NILGES M A， et al. A role for specific collagen motifs during wound healing and inflammatory response of fibroblasts in the teleost fish gilthead seabream[J]. Molecular Immunology， 2011，48（6/7）：826-834.

[18] WILGUS T A， DIPIETRO L A. Complex roles for VEGF in dermal wound healing[J]. Journal of Investigative Dermatology， 2012，132（2）：493-494.

[19] CORRAL C J， SIDDIQUI A， WU L C， et al. Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblastic growth factor during ischemic wound healing[J]. Archives of Surgery， 1999，134（2）：200-205.

[20] XU Li， XIANG Xudong， JI Xiaoying， et al. Effects and me-chanism of dehydroepiandrosterone on epithelial-mesenchymal transition in bronchial epithelial cells[J]. Experimental Lung Research， 2014，40（5）：211-221.

[21] DURAO J， VALE N， GOMES S， et al. Nitric oxide release from antimicrobial peptide hydrogels for wound healing[J]. Biomolecules， 2019，9（1）. doi：10.3390/biom9010004.

（本文編輯 馬偉平）