他克莫司對阿霉素腎病大鼠腎組織氧化應激及klotho蛋白表達的影響

張靜　王雁飛　劉麗秋　宋起

[摘要] 目的 觀察他克莫司對阿霉素腎病大鼠腎組織氧化應激及klotho蛋白表達的影響。方法 將雄性Wistar大鼠隨機分為對照組（NC組）、阿霉素腎病模型組（ADR組）、奧美沙坦酯治療組（OLM組）、他克莫司治療組（FK506組），每組15只。其中ADR組、OLM組、FK506組均給予一次性尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg構建阿霉素腎病模型。造模成功后，OLM組、FK506組分別連續12周給予奧美沙坦酯10 mg/（kg·d）、他克莫司0.5 mg/（kg·d）灌胃，NC組及ADR組分別給予等量生理鹽水灌胃。分別于實驗第4、8、12周末檢測各組大鼠24 h尿蛋白;每組分別于實驗第4、8、12周末各處死5只大鼠，取腎組織，測定其超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，蘇木精-伊紅染色觀察其形態學變化，實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測klotho mRNA的表達，Wes-tern blot檢測klotho蛋白的表達。結果 ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點24 h尿蛋白含量均高于NC組，OLM組和FK506組較ADR組降低，FK506組較OLM組降低，差異均有顯著性（F=126.969～781.905，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中SOD活性均較NC組降低，OLM組和FK506組較ADR組升高，FK506組較OLM組升高，差異均有統計學意義（F=125.782～467.589，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中MDA含量均較NC組升高，OLM組及FK506組較ADR組降低，FK506組較OLM組降低，差異均有統計學意義（F=52.782～162.589，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中klotho的表達均較NC組降低，OLM組及FK506組較ADR組升高，FK506組較OLM組升高，差異具有統計學意義（F=116.671～609.513，P<0.05）。結論 阿霉素腎病大鼠腎臟組織klotho表達降低，他克莫司相對于奧美沙坦酯可以明顯提高阿霉素腎病大鼠腎臟組織中klotho的表達，減少腎臟氧化應激損傷。

[關鍵詞] 他羅利姆;腎病綜合征;多柔比星;氧化性應激;klotho蛋白;大鼠

[中圖分類號] R979.5;R692 ?[文獻標志碼] A ?[文章編號] ?2096-5532（2019）04-0469-06

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of tacrolimus on oxidative stress and klotho protein expression in renal tissue in rats with adriamycin nephropathy. ?Methods A total of 60 male Wistar rats were randomly divided into normal control group （NC group）， adriamycin nephropathy group （ADR group）， olmesartan medoxomil treatment group （OLM group）， and tacrolimus treatment group （FK506 group）， with 15 rats in each group. The rats in the ADR group， the OLM group， and the FK506 group were given one-time injection of 5 mg/kg adriamycin via the caudal vein to establish a model of adriamycin nephropathy. After modeling， the rats in the OLM group and the FK506 group were given olmesartan medoxomil （10 mg·kg-1·d-1） and tacrolimus （0.5 mg/kg-1·d-1）， respectively， by gavage for 12 consecutive weeks， and those in the NC group and the ADR group were given an equal volume of normal saline by gavage. 24 h urinary protein was measured at the end of weeks 4， 8， and 12. Five rats in each group were sacrificed at the end of weeks 4， 8， and 12， and renal tissue was collected to measure superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） content; hematoxylin and eosin staining was used to observe morphological changes， and quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of klotho. ?Results At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly higher 24 h urinary protein than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly lower 24 h urinary protein than the ADR group; the FK506 group had significantly lower 24 h urinary protein than the OLM group （F=126.969-781.905，P<0.05）. At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly lo-wer SOD activity in renal tissue than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly higher SOD activity than the?ADR group; the FK506 group had significantly higher SOD activity than the OLM group （F=125.782-467.589，P<0.05）. At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly higher MDA content in renal tissue than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly lower MDA content than the ADR group; the FK506 group had significantly lower MDA content than the OLM group （F=52.782-162.589，P<0.05）. At all time points， the ADR group， the OLM group， and the FK506 group had significantly lower expression of klotho in renal tissue than the NC group; the OLM group and the FK506 group had significantly higher expression than the ADR group; the FK506 group had significantly higher expression than the OLM group （F=116.671-609.513，P<0.05）. ?Conclusion There is a reduction in the expression of klotho in renal tissue in rats with adriamycin nephropathy. Compared with olmesartan medoxomil， tacrolimus can significantly increase the expression of klotho in renal tissue and reduce oxidative stress injury in the kidney in rats with adriamycin nephropathy.

[KEY WORDS] tacrolimus; nephrotic syndrome; doxorubicin; oxidative stress; klotho protein; rats

腎病綜合征是一種發展緩慢、相對良性的疾病，但若未能及時有效診治可導致病情進展甚至發展成為慢性腎衰竭。氧化應激是多種病理損傷的共同途徑，貫穿于慢性腎臟病發生、發展的過程中。慢性腎臟病的發生、發展及惡化與體內氧化物質增多、抗氧化物質減少密切相關[1]。KURO-O等[2]研究顯示，klotho主要在腎臟中高表達。MITANI等[3]采用原位雜交技術研究表明，Klotho mRNA主要在腎小管上皮細胞中表達，氧化應激和腎素-血管緊張素系統（RAS）的激活可以抑制其在腎臟中的表達。有研究結果表明，在腎小球腎炎模型小鼠體內過表達klotho蛋白，可使小鼠具有對抗氧化應激從而減少腎損傷的功能[4]。以上研究表明，klotho蛋白在體內能夠抑制氧化應激，可以通過檢測klotho蛋白在體內的表達水平估測小鼠腎臟的損傷情況。奧美沙坦酯為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，臨床上常用于降低血壓和減少尿蛋白。有研究表明，奧美沙坦酯通過抑制血管緊張素Ⅱ引起的氧化應激起到保護腎臟的作用[5]。他克莫司為新型免疫抑制劑，屬于鈣調神經蛋白酶抑制劑，可對鈣離子傳導通路進行干擾，特異性提高細胞內鈣離子濃度，減弱細胞去磷酸化功能，對白細胞介素分泌進行控制，發揮免疫抑制作用，近年來開始應用于腎病綜合征的臨床治療，具有減少尿蛋白、延緩腎臟疾病進展的作用。本研究采用單次尾靜脈注射阿霉素方法建立阿霉素腎病模型，給予奧美沙坦酯及他克莫司灌胃治療，探討兩種藥物對模型大鼠腎臟氧化應激反應及klotho蛋白表達的影響，以期為他克莫司治療腎病綜合征提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級雄性Wistar大鼠60只，體質量230～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006，飼養于青島大學醫學院動物房。

1.1.2 主要試劑 奧美沙坦酯（第一三共制藥（上海）有限公司），鹽酸阿霉素（MedChemExpress），他克莫司（Astellas Ireland Co.，Ltd），兔抗鼠anti-klotho多克隆抗體（英國Abcam），β-actin（北京博奧森），免疫組化試劑盒（北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（福州邁新），蘇木精-伊紅染色試劑（北京索萊寶），Trizol試劑（美國Invitrogen），cDNA反轉錄試劑盒和RT-PCR試劑盒（北京Takara）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組（NC組）、阿霉素腎病模型組（ADR組）、奧美沙坦酯治療組（OLM組）以及他克莫司治療組（FK506組），每組15只。其中ADR組、OLM組和FK506組大鼠給予一次性尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg造模，NC組大鼠注射等量的生理鹽水。7 d后留取大鼠24 h尿蛋白，與正常對照大鼠相比，尿蛋白升高有統計學意義視為造模成功[6]。造模后，OLM組連續12周給予奧美沙坦酯10 mg/（kg·d）灌胃[5]，FK506組連續12周給予他克莫司0.5 mg/（kg·d）灌胃[7]，NC組及ADR組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.2 24 h尿蛋白檢測 于實驗第4、8、12周末從每組中隨機各選5只大鼠放入清潔代謝籠中，收集24 h尿液，-80 ℃保存，用于檢測24 h尿蛋白定量。實驗重復3次，取均值。

1.2.3 標本采集 分別于實驗第4、8、12周末每組取5只大鼠，處死，打開腹腔游離腎臟。迅速取出一側腎臟放入40 g/L中性甲醛中固定，4 ℃保存，用于蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學染色;將另一側腎組織快速放入液氮中，-80 ℃保存，用于Wes-tern blot和實時熒光定量PCR（q-PCR）。

1.2.4 腎組織病理學觀察 腎組織經包埋制成石蠟切片，切片脫蠟、復水后經蘇木精染色10 min、伊紅染色5 min，脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察腎組織病理改變。

1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的測定 采用羥胺法檢測大鼠腎組織中SOD活性，采用比色法檢測大鼠腎組織中MDA含量。均嚴格按照試劑盒說明進行操作。實驗重復3次，取均值。

1.2.6 Western blot檢測klotho蛋白的表達 提取腎組織中總蛋白，加入RIPA裂解液勻漿后，用BCA法檢測蛋白濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液，金屬浴煮沸5 min，各組蛋白分別上樣，用100 g/L SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜上，以體積分數0.05的牛奶封閉1 h，加入一抗klotho（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗常溫孵育，洗膜后顯影，用Image J軟件分析蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.2.7 q-PCR檢測klotho mRNA的表達 按照Triol試劑說明書提取腎組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行q-PCR。引物由睿博興科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。反應條件為：95 ℃、10 s，57 ℃、30 s，共40個循環。用2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。

1.3 統計學分析

應用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析，所得實驗數據以±s表示，數據間比較采用析因設計的方差分析，相關性分析采用Spearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 ?果

2.1 造模后大鼠一般情況

大鼠尾靜脈注射阿霉素1周后均出現不同程度的腹瀉，食量下降，活動減少;2周后腹瀉逐漸停止，飲食及活動逐漸恢復;第3周出現輕度水腫，以足部及睪丸最明顯;第4周水腫最重。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較

大鼠24 h尿蛋白定量檢測組別與時間存在交互效應（F時間×組別=101.579，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點24 h尿蛋白含量均高于NC組，OLM組和FK506組較ADR組降低，FK506組較OLM組降低，差異均有統計學意義（F=126.969～781.905，P<0.05）;組內比較，隨著時間的延長，ADR組24 h時尿蛋白含量進行性升高，OLM組和FK506組進行性降低，差異具有統計學意義（F=16.957～182.942，P<0.05）。見表2。

2.3 大鼠腎組織病理學觀察

與NC組相比，ADR組實驗第4周末可見腎小管上皮細胞輕度萎縮，上皮細胞內有顆粒和空泡變性，近端小管上皮細胞刷狀緣脫落、管腔擴大并可見蛋白管型及少量炎細胞浸潤;第8周末可見腎小管上皮細胞明顯萎縮，空泡及顆粒變性更加明顯，管內蛋白管型較前增多，間質血管腫脹更加明顯，炎細胞數量增多;第12周末可見腎小管灶狀萎縮，蛋白管型更多，腎間質小動脈管壁增厚、管腔狹窄，間質內炎細胞浸潤更加明顯，并有輕度纖維化。OLM組和FK506組大鼠腎臟的病理表現較ADR組呈時間依賴性的減輕，且FK506組病理改變較OLM組更加明顯。

2.4 各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量比較

大鼠腎組織SOD活性檢測組別與時間存在交互效應（F時間×組別= 201.531，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中SOD活性均較NC組降低，OLM組和FK506組較ADR組升高，FK506組較OLM組升高，差異均有顯著意義（F=125.782～467.589，P<0.05）;組內比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中SOD活性進行性降低，OLM組及FK506組進行性升高，差異具有顯著性（F=6.871～57.072，P<0.05）。見表3。

大鼠腎組織MDA含量檢測組別與時間存在交互效應（F時間×組別= 67.026，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中MDA含量均較NC組升高，OLM組及FK506組較ADR組降低，FK506組較OLM組降低，差異具有統計學意義（F=52.782～162.589，P<0.05）;組內比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中MDA含量進行性升高，OLM組及FK506組進行性降低，差異具有顯著性（F=6.871～57.072，P<0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠腎組織中klotho mRNA表達的比較

大鼠腎組織中klotho mRNA表達檢測組別與時間存在交互效應（F時間×組別=326.571，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中klotho mRNA的表達均較NC組降低，OLM組及FK506組較ADR組升高，FK506組較OLM組升高，差異具有統計學意義（F=116.671～507.513，P<0.05）;組內比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中klotho mRNA的表達進行性降低，OLM組和FK506組的表達進行性升高，差異具有統計學意義（F=12.982～40.485，P<0.05）。見表5。

2.6 各組大鼠腎組織中klotho蛋白表達的比較

大鼠腎組織中klotho蛋白表達檢測組別與時間存在交互效應（F時間×組別=223.581，P<0.05）。ADR組、OLM組及FK506組大鼠各時間點腎組織中klotho蛋白的表達均較NC組降低，OLM組及FK506組較ADR組升高，FK506組較OLM組升高，差異具有統計學意義（F=126.969～609.513，P<0.05）;組內比較，隨著時間的延長，ADR組大鼠腎組織中klotho蛋白表達進行性降低，OLM組和FK506組進行性升高，差異具有統計學意義（F=10.985～38.405，P<0.05）。見圖1。

2.7 klotho表達與氧化應激的關系

大鼠腎組織中klotho蛋白表達與MDA含量及24 h尿蛋白定量呈負相關（r=-0.896、-0.948，P<0.01），與SOD活性呈正相關（r=0.927，P<0.01）。見圖2。

3 討 ?論

阿霉素腎病模型是目前公認的腎病綜合征動物模型。阿霉素對腎臟具有慢性毒性作用，它可以通過多種機制引起腎臟損傷，其中氧化應激是比較常見和重要的機制之一。有研究表明，活性氧（ROS）是引起足細胞損傷的重要因素[8]。另有研究表明，ROS可引起腎小管內皮細胞損傷，影響腎小管的重吸收作用，從而導致大量蛋白質隨尿液排出體外，引起蛋白尿[9]。蛋白尿是診斷腎病綜合征的標準之一，也是腎功能進展的獨立危險因素。Klotho是一種與衰老相關的基因，其對機體的保護作用已經被廣泛報道[10]。LIM等[11]研究表明，klotho通過抑制氧化應激、RAS激活和改善線粒體功能發揮腎臟保護作用。另有研究表明，klotho過表達轉基因小鼠的錳超氧化物歧化酶（MnSOD）表達量升高[12-13]，從而起到抑制氧化應激的作用。然而有研究表明，當機體出現氧化應激時，klotho基因在腎臟的轉錄及表達均減少[4]。ROS的產生是阿霉素腎病模型大鼠腎臟損傷的主要原因，因此，抑制氧化應激不僅可減輕其對腎臟的損傷還可提高klotho基因在腎小管上皮細胞的表達，從而起到保護腎臟的作用。

研究表明，腎臟RAS過度激活與許多腎臟疾病有關，RAS過度激活的主要效應包括氧化應激、NF-κB激活、纖維母細胞增殖及細胞外基質過度沉積等[14]。血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）類藥物具有降血壓、減少尿蛋白及保護腎臟的作用，其減少尿?蛋白的主要機制為阻斷RAS，減少血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的產生。本研究以Wistar大鼠作為研究對象，采用一次性尾靜脈注射阿霉素方法建立阿霉素腎病模型，模型大鼠分別給予奧美沙坦酯和他克莫司治療12周，結果顯示，奧美沙坦酯組和他克莫司組24h尿蛋白定量均較ADR組明顯降低，證明奧美沙坦酯及他克莫司均具有減少尿蛋白的作用，這與既往的研究結論一致[15-16]。且他克莫司減少尿蛋白的療效優于奧美沙坦酯。ACEI類藥物可減少AngⅡ的產生，也具有抗氧化的作用。局部AngⅡ與血管緊張素Ⅱ1型受體（AngⅡ1）結合后可激活NADH/NADPH氧化酶，使O2-、H2O2等ROS類物質生成增多。AngⅡ還可作用于血管內皮細胞，刺激其產生ROS增加，從而使血漿氧化應激水平升高[17-18]。本研究結果顯示，在分別給予奧美沙坦酯和他克莫司治療4、8及12周后，奧美沙坦酯組及他克莫司組氧化應激反應均較模型組明顯減弱，且他克莫司減弱氧化應激的作用較奧美沙坦酯更加明顯，表明他克莫司能有效減輕氧化應激對腎臟的損害，其對腎臟的保護作用優于奧美沙坦酯。有動物實驗結果表明，AngⅡ可下調klotho在腎臟中的表達[19]。糖尿病腎病大鼠給予纈沙坦治療后，其腎臟組織中klotho蛋白表達水平升高而氧化應激反應降低[15]。另有研究表明，在慢性腎衰竭病人體內，klotho的表達量明顯下降，RAS和氧化應激激活可抑制klotho在腎臟表達[20]。其機制可能是klotho通過抑制胰島素樣/胰島素樣生長因子-1介導的FoxO磷酸化而活化FoxO轉錄因子[21-22]，去磷酸化的FoxO能夠反過來上調抗氧化酶如過氧化氫酶-1和SOD的表達。本研究結果顯示，在實驗第4周末，ADR組大鼠腎組織中klotho的表達開始降低，第8、12周末降低更加明顯;分別給予奧美沙坦酯和他克莫司灌胃治療后，模型大鼠klotho的表達升高。實驗第4、8、12周末，OLM組和FK506組大鼠腎組織中klotho的表達均較ADR組顯著增加，且FK506組較OLM組增加更加明顯。

綜上所述，阿霉素腎病大鼠klotho表達下降與腎病綜合征的發生、發展密切相關;在阿霉素腎病大鼠模型中，奧美沙坦酯和他克莫司均具有抑制氧化應激反應、提高腎組織中klotho表達進而達到保護腎臟的作用，但他克莫司保護腎臟的作用優于奧美沙坦酯。這兩種藥物的長期療效、安全性及腎臟保護作用的具體分子機制目前尚不清楚，還需進一步研究。

[參考文獻]

[1] YILMAZ M I， SIRIOPOL D， SAGLAM M， et al. Osteoprotegerin in chronic kidney disease：associations with vascular damage and cardiovascular events[J]. Calcified Tissue International， 2016，99（2）：121-130.

[2] KURO-O M， MATSUMURA Y， AIZAWA H， et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing[J]. Nature， 1997，390（6655）：45-51.

[3] MITANI H， ISHIZAKA N， AIZAWA T， et al. In vivo klotho gene transfer ameliorates angiotensin Ⅱ-induced renal damage[J]. Hypertension， 2002，39（4）：838-843.

[4] 徐辰. KLOTHO基因介導鈣磷代謝與慢性腎臟病關系的研究進展[J]. 國際泌尿系統雜志， 2012，32（5）：692-695.

[5] 盧曉梅，馬玲，于艷秋. 奧美沙坦酯對慢性心力衰竭小鼠腎臟氧化應激的作用[J]. 中華腎臟病雜志， 2011，27（3）：190-193.

[6] 張勇，張蓓，寧華英，等. 單次尾靜脈注射法阿霉素大鼠腎病模型的建立[J]. 中國實驗動物學報， 2013，21（1）：1-4，107.

[7] QI X M， WANG J， XU X X， et al. FK506 reduces albuminuria through improving podocyte nephrin and podocin expression in diabetic rats[J]. Inflammation Research， 2016，65（2）：103-114.

[8] PAVENSTADT H， KRIZ W， KRETZLER M. Cell biology of the glomerular podocyte[J]. Physiological Reviews， 2003，83（1）：253-307.

[9] VALKO M， RHODES C J， MONCOL J， et al. Free radicals， metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer[J]. Chemico-Biological Interactions，2006，160（1）：1-40.

[10] XIAO Nengming， ZHANG Yanming， ZHENG Quan， et al. Klotho is a serum factor related to human aging[J]. Chinese Medical Journal， 2004，117（5）：742-747.

[11] LIM S C， LIU J J， SUBRAMANIAM T， et al. Elevated circulating alpha-klotho by angiotensin Ⅱ receptor blocker losartan is associated with reduction of albuminuria in type 2 diabetic patients[J]. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System， 2014，15（4）：487-490.

[12] JIN J， JIN L， LIM S W， et al. Klotho deficiency aggravates tacrolimus-induced renal injury via the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-forkhead box protein O pathway[J]. American Journal of Nephrology， 2016，43（5）：357-365.

[13] YAMAMOTO M， CLARK J D， PASTOR J V， et al. Regulation of oxidative stress by the anti-aging hormone Klotho[J]. Journal of Biological Chemistry， 2005，280（45）：38029-38034.

[14] 賀明，陸利民，姚泰. 腎素-血管緊張素系統在調節腎臟活動和慢性腎功能不全中的作用[J]. 生理科學進展， 2004，35（2）：188-192.

[15] 武曉碧，汪曉霞，張希堯，等. 纈沙坦對糖尿病大鼠klotho蛋白及氧化應激影響的研究[J]. 中國糖尿病雜志， 2017，25（8）：733-736.

[16] SHEN Xiujin， JIANG Hong， YING Meike， et al. Calcineurin inhibitors cyclosporin A and tacrolimus protect against podocyte injury induced by puromycin aminonucleoside in rodent models[J]. Scientific Reports， 2016，6（6）：32087-32116.

[17] HAUGEN E N， CROATT A J， NATH K A. Angiotensin Ⅱ induces renal oxidant stress in vivo and heme oxygenase-1 in vivo and in vitro[J]. Kidney International， 2000，58（1）：144-152.

[18] 常潔，姜宗培，張海燕，等. NADPH氧化酶介導血管緊張素Ⅱ誘導的腹膜間皮細胞轉分化及細胞外基質積聚[J]. 中華腎臟病雜志， 2007，23（5）：328-333.

[19] YOON H E， GHEE J Y， PIAO S， et al. Angiotensin Ⅱ bloc-kade upregulates the expression of Klotho， the anti-ageing gene， in an experimental model of chronic cyclosporine nephropathy[J]. Nephrology Dialysis Transplantation， 2011，26（3）：800-813.

[20] DEVARAJ S， SYED B， CHIEN A， et al. Validation of an immunoassay for soluble klotho protein decreased levels in diabetes and increased levels in chronic kidney disease[J]. American Journal of Clinical Pathology， 2012，137（3）：479-485.

[21] SENGUPTA A， MOLKENTIN J D， PAIK J H， et al. FoxO transcription factors promote cardiomyocyte survival upon induction of oxidative stress[J]. The Journal of Biological Che-mistry， 2011，286（9）：7468-7478.

[22] GREER E L， BRUNET A. FOXO transcription factors at the interface between longevity and tumor suppression[J]. Oncogene， 2005，24（50）：7410-7425.

（本文編輯 馬偉平）