不同種類牛黃投料的小兒化毒膠囊（散）中膽紅素的研究

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摘要?目的：建立“小兒化毒膠囊（散）”中游離膽紅素、總膽紅素以及部分膽紅素的HPLC測定方法，比較以人工牛黃、體外培育牛黃2種牛黃分別投料的小兒化毒散之間差異。方法：分別以二氯甲烷、10%草酸溶液（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）-二氯甲烷、0.2 mol/L乙二胺四醋酸二鈉-二氯甲烷提取樣品中游離膽紅素、部分膽紅素、總膽紅素，用HPLC法測定，固定相為C18色譜柱，流動相為乙腈-1%冰乙酸（95∶5），檢測波長450 nm，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min。結果：膽紅素在5.64～282 ng范圍內線性關系良好，游離膽紅素、部分膽紅素、總膽紅素平均加樣回收率為90%～95%，RSD分別為4.2%、4.1%和4.9%，2種牛黃投料的小兒化毒散中膽紅素含量及形態存在明顯差異。結論：建立的方法可有效識別“小兒化毒膠囊（散）”中牛黃的投料種類，為其他含有牛黃的中藥制劑質量評價提供了借鑒。

關鍵詞?小兒化毒膠囊（散）;人工牛黃;體外培育牛黃;游離膽紅素;總膽紅素;部分膽紅素;高效液相

Study on Bilirubin in Xiaoer Huadu Capsule Made of Different Calculus Bovis

Feng Rui1，Xia Jing1，Pan Jie1，2，Hu Qing1，Mao Xiuhong1，Ji Shen1

（1 Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China; 2 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To establish an HPLC methods for free，portion and total bilirubin in Xiaoer Huadu Capsule（Powder）and compare the difference between 2 types of Calculus Bovis.Methods：The free，portion and total bilirubin were extracted with dichloromethane，10% oxalic acid solution（containing 0.15% cetyltrimethylammonium chloride）-dichloromethane，0.2 mol/L disodium ethylenediaminetetraacetate-dichloromethane，determined by HPLC with C18 column，the mobile phase was acetonitrile-1%glacial acetic acid（95∶5）.The detection wavelength is 450 nm，and the column temperature was 25 ℃.The flow rate was 1.0 mL/min.Results：Bilirubin showed good linear relationship in the range of 5.64 ng-282 ng，and the average recoveries of free，portion and total bilirubin was 90%-95%，with RSD 4.2%，4.1% and 4.9%.There were significant differences in the content and form of bilirubin of 2 kinds of Calculus Bovis.Conclusion：The method established is easy to operate with high effectiveness in identifying bezoar in Xiaoer Huadu Jiaonang and other Chinese traditional patent medicines containing Calculus Bovis.

Key Words?Xiaoer Huadu Capsule（Powder）; Artificial calculus bovis; Cultured calculus bovis in vitro; Free bilirubin; Total bilirubin; Portion bilirubin; HPLC

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.002

“小兒化毒散”現收載于中華人民共和國藥典2015年版1部，由人工牛黃、珍珠、大黃、雄黃、黃連、甘草、天花粉、川貝母、赤芍、乳香（制）、沒藥（制）、冰片十二味藥組成，具有清熱解毒、活血消腫的功能，常用于熱毒內蘊、毒邪未盡所致的口瘡腫痛、瘡瘍潰爛[1]?！靶夯灸z囊”的質量標準中處方量和制法均保密，經團隊調研發現該品種是由小兒化毒散改變劑型而來，且用法、用量以及規格基本一致，因此對2個品種合并研究。

“小兒化毒膠囊”為西安碑林藥業控股有限公司的獨家產品，處方中原使用牛黃，2013年向國家食品藥品監督管理局備案藥品注冊補充申請，使用人工牛黃代替牛黃投料[2]。含有牛黃的經典方劑多與雄黃、朱砂等礦物藥配伍，而此類方劑的安全性一直以來受到高度的關注[3-5]。有研究表明，安宮牛黃丸中牛黃等其他藥味與雄黃配伍后，可降低可溶性砷含量而具有減毒作用[6]，人工牛黃是否可以發揮出牛黃的作用成為了目前討論的熱點。但是目前中華人民共和國藥典中“小兒化毒膠囊（散）”現行質量標準尚無針對牛黃的質控項目和檢測手段。因此，建立一個針對“小兒化毒膠囊（散）”質量控制方法迫在眉睫。

膽紅素是牛黃及其替代品的主要成分之一，近幾年研究發現其在機體中發揮著抗氧化、抗凋亡、免疫調節等作用[7-9]，又因為膽紅素的性質較為特殊，光、熱等多種因素都會導致其變性[10]，導致分析較為困難，在實際操作中以游離膽紅素、部分膽紅素（游離膽紅素+結合膽紅素）和總膽紅素（游離膽紅素+結合膽紅素+共價膽紅素）的形式進行測定。本研究根據已有的文獻報道[11-15]，通過對不同種類牛黃投料的“小兒化毒膠囊（散）”中所含膽紅素進行研究，分別建立了游離膽紅素、總膽紅素以及部分膽紅素的HPLC法測定方法，結合該3種方法可有效控制投料牛黃的質量，從而對“小兒化毒膠囊（散）”質量進行監控。并且通過分析膽紅素的含量[16]，可有效鑒別“小兒化毒膠囊（散）”中牛黃投料的品種。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

Agilent 1100液相色譜儀（美國Agilent公司）;超聲波清洗儀（上?？茖С晝x器有限公司SK8210LHC）;離心機（Eppendorf 5430R）;旋渦混合器（IKA MS2）。

1.2?試劑

膽紅素對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，批號10077-200503，純度99.0%，使用前無需處理）;草酸、十六烷基三甲基氯化銨均購自國藥集團化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉（化學純）購自國藥集團化學試劑有限公司;二氯甲烷、冰醋酸均為分析純，購自上海凌峰化學試劑有限公司，色譜純級乙腈。

1.3?樣品

由于目前在售和生產的小兒化毒散/膠囊樣品極少，故委托武漢健民大鵬藥業有限公司按處方模擬生產體外培育牛黃制和人工牛黃制小兒化毒散各3批，除牛黃品種不同外，其余藥味均采用同一原料;另收集了西安碑林藥業股份有限公司生產的小兒化毒膠囊1批，具體樣品見表1。

2?方法與結果

2.1?供試品的制備

2.1.1?游離膽紅素含量測定?取小兒化毒散（批號：XES-1）研細，精密稱取約210 mg，置錐形瓶中，精密加入二氯甲烷20 mL，稱定重量，分別冰浴超聲（功率500 W，頻率53 kHz）30 min，再稱定重量，用二氯甲烷補足減失的重量，搖勻，取二氯甲烷液用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算。

2.1.2?部分膽紅素含量測定?取小兒化毒散（批號：XES-3）研細，精密稱取約0.12 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，分別加入不同體積的0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液，密塞，渦旋均勻，精密加入水飽和二氯甲烷25 mL，密塞，稱定重量，渦旋混勻，冰浴超聲處理（功率500 W，頻率53 kHz）30 min，再稱定重量，用水飽和二氯甲烷補足減失的重量，搖勻，取二氯甲烷液，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算。

2.1.3 總膽紅素含量測定?取小兒化毒散（批號：XES-1）研細，精密稱取約0.12 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同體積的10%草酸溶液（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨），密塞，渦旋均勻，精密加入水飽和二氯甲烷25 mL，密塞，稱定重量，渦旋混勻，冰浴超聲處理（功率500 W，頻率53 kHz）30 min，再稱定重量，用水飽和二氯甲烷補足減失的重量，搖勻，離心（4 000 r/min），取二氯甲烷液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算。

2.3?色譜條件與系統實用性實驗

2.3.1?檢測波長?取膽紅素對照品溶液進行紫外-可見分光光度掃描，結果在450 nm波長處有最大吸收，對膽紅素對照品色譜和供試品色譜中膽紅素色譜峰進行二極管陣列掃描，結果顯示，兩者均在450 nm波長處有最大吸收且干擾峰極少，故選擇450 nm作為檢測波長。

2.3.2?色譜條件及專屬性試驗?色譜柱：迪馬Diamonsil（5 μm，0.46 cm×15 cm）;流動相：乙腈-1%冰乙酸（95∶5）;檢測波長：450 nm;柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL/min;進樣量：5 μL。供試品色譜中，具與膽紅素對照品保留時間一致的色譜峰，且無其他成分干擾?？瞻讟悠罚ㄈ迸｜S）在膽紅素對照品保留時間處無色譜峰，無干擾。供試品色譜中，具與膽紅素對照品保留時間一致的色譜峰，且無其他成分干擾?？瞻讟悠罚ㄈ迸｜S）在膽紅素對照品保留時間處無色譜峰，無干擾，方法專屬性較好。見圖1。

2.4?耐用性試驗

由于不同生產廠家不同牌號的色譜柱存在填料及性能上的差異，為考察擬訂方法的可行性及通用性，對1）TSKgel ODS-100V（0.46 cm×25 cm，5 μm）、2）Agilent Eclipse Plus C18（0.46 cm×15 cm，5 μm）、3）Boston Green ODS（0.46 cm×15 cm，5 μm）3根色譜柱進行了考察。3根色譜柱均得到的供試品色譜均具與對照品保留時間一致的色譜峰，且峰形均較對稱、尖銳，對稱因子分別為0.78、1.04、1.12;理論板數分別為14 933、6 797、6 946。表明擬訂方法通用性較廣。

2.5?膽紅素線性關系考察

精密量取膽紅素對照品適量，加二氯甲烷分別制成含膽紅素1.128 μg/mL（ST1）、11.28 μg/mL（ST2）、56.4 μg/mL（ST3）的對照品溶液。

分別精密吸取ST1溶液5 μL，ST2溶液1 μL、2 μL、5 μL，ST3溶液2 μL、4 μL和5 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，膽紅素在進樣量5.64～282 ng范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。具體見表2。

2.6?重復性試驗

因樣品中游離膽紅素含量太低，因此以加樣回收率來考察方法重復性，總膽紅素和部分膽紅素直接考察方法重復性。

取編號為2、4的小兒化毒散（含體外培育牛黃，4號樣品進行部分膽紅素測定）樣品平行制備6份供試品溶液進行測定，游離膽紅素、總膽紅素和部分膽紅素的RSD分別為3.1%，4.2%和4.1%，表明重復性良好。

2.7?穩定性試驗

參考含牛黃的同系列品種，膽紅素對照品在24小時內穩定。

分別取游離膽紅素、部分膽紅素及總膽紅素供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h進行測定，記錄峰面積，RSD分別為3%，1.28%，0.17%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.8?準確度試驗

2.8.1?游離膽紅素試驗準確度?取2號小兒化毒散樣品（游離膽紅素含量為0.0398 mg/g）研細，精密稱取約210 mg，一式9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每3份為一組，分別精密加入對照品溶液（6.702 3 μg/mL）20 mL、10 mL、5 mL，精密加入二氯甲烷至20 mL，自“密塞”起同供試品溶液制備，進樣測定，測定結果見表3。

結果表明，準確度處于85%～105%之間，RSD值小于5%，表明擬訂的游離膽紅素方法準確度良好。

2.8.2?總膽紅素試驗準確度?取2號小兒化毒散樣品（含量為4.02 mg/g）研細，取約0.06 g，一式9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，每組分別精密加入對照品加樣溶液（16.755 75 μg/mL）10 mL、15 mL、20 mL，再分別精密加入水飽和二氯甲烷溶液15 mL、10 mL和5 mL，自“加入10%草酸溶液（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）8 mL”起按供試品溶液的制備方法制備，進樣測定。見表4。

結果表明：方法的準確度處于90.0～110.0%之間，RSD值小于5%，擬定的總膽紅素測定方法準確度較好。

2.8.3?部分膽紅素試驗準確度?取4號小兒化毒散樣品（含量為3.42 mg/g）研細，取約0.06 g，一式9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每3份為1組，每組分別精密加入對照品加樣溶液（17.436 375 μg/mL）5 mL、8 mL、12 mL，再分別精密加入水飽和二氯甲烷溶液20 mL、17 mL、13 mL，自“加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉5 mL”起按供試品溶液的制備方法制備，進樣測定，結果見表5。

結果表明：方法的準確度處于90.0～110.0%之間，RSD值小于5%，擬定的部分膽紅素測定方法準確度較好。

2.9?樣品測定

按供試品溶液制備及測定方法測定各樣品中游離膽紅素、總膽紅素及部分膽紅素的含量，結果見表6。

3?討論

3.1?供試品溶液的制備

根據已有文獻[15]的記載膽紅素易受光、熱和金屬離子的影響而加速分解，所以實驗過程中應在避光、冰水浴的條件下進行。膽紅素在三氯甲烷中較為穩定，但游離膽紅素與結合膽紅素、共價膽紅素的性質存在差異，當親水性較強的結合膽紅素、共價膽紅素被解離成游離膽紅素后，脂溶性增強，故選用二氯甲烷作為主溶劑。

為防止金屬離子對膽紅素提取的影響，還需在溶劑中加入金屬螯合劑對金屬離子進行螯合。根據共價膽紅素以及結合膽紅素的特點，分別選用10%草酸（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）和0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉作為總膽紅素和部分膽紅素的提取螯合劑。此外本研究還對螯合劑加入體積進行了考察，平行取樣8份，分別加入2、5、8、10 mL螯合劑，平行操作進行提取，根據液相中的峰面積及穩定性來篩選最優加入體積，最終選擇加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸二鈉5 mL，10%草酸（含0.15%十六烷基三甲基氯化銨）8 mL提取部分膽紅素和總膽紅素。

本研究還考察了樣品超聲提取的時間，平行取樣12份分為6組，分別避光冰浴超聲10、20、30、40、50、60后進行提取，根據液相中的峰面積及穩定性來篩選最優超聲時間，最終選擇超聲處理30分鐘來提取“小兒化毒膠囊（散）”中的3種膽紅素。

3.2?結果分析

體外培育牛黃投料的“小兒化毒膠囊（散）”相比于人工牛黃投料的“小兒化毒膠囊（散）”總膽紅素和部分膽紅素含量較高，游離膽紅素含量則符合藥典規定限量。針對總膽紅素，中華人民共和國藥典2015年版一部中“人工牛黃”膽紅素含量限度為“按干燥品計算，含膽紅素（C33H36N4O6）不得少于0.63%”，水分限度為不得過5.0%，方法同為紫外—可見分光光度法。按人工牛黃中牛黃處方量，及液相與紫外—可見分光光度法的差異本品理論含量限度應為每g不少于71.4 μg膽紅素（人工牛黃）。考慮到原料制成制劑的損失，且膽紅素易分解，以理論量的70%制訂含量限度。即“本品每g含人工牛黃以膽紅素計，不得少于45 μg”。含人工牛黃的3批樣品含量均未達到限度。對于體外培育牛黃，根據中華人民共和國藥典有關含量限度，含體外培育牛黃的4批樣品含量均符合規定。

人工牛黃投料的小兒化毒散中總膽紅素以及部分膽紅素的含量遠低于體外培育牛黃投料制劑，因此人工牛黃對雄黃的減毒作用及其本身的藥效都不及體外培育牛黃?？紤]到處方中含有雄黃，又是小兒用藥，故建議將中華人民共和國藥典中“小兒化毒膠囊（散）”處方中的人工牛黃重新改為牛黃（包括天然牛黃及體外培育牛黃）。

本研究建立的方法可快速、準確測定“小兒化毒膠囊（散）”中的游離膽紅素、總膽紅素和部分膽紅素，可以有效區分所投牛黃是人工牛黃還是體外培育牛黃，并進一步對投料牛黃進行質量評價，為其他含牛黃的中藥制劑的質量控制提供借鑒。

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