QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定三七中26種真菌毒素

王少敏　杜春曉　劉賢賢　劉冠萍　毛丹　梁云飛　黃曉靜　朱小鳳　陳鈳　季申

摘要?目的：采用改良QuEChERS前處理技術，建立了超快速液相色譜-串聯質譜（Ultra-High-performance Liquid Chromatography-TandemMass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）檢測中藥三七中26種真菌毒素含量的分析方法。方法：樣品用QuEChERS方法進行前處理，經15%甲酸乙腈溶液提取，用混合凈化填料凈化除雜，采用基質匹配標準曲線結合同位素內標法進行定量分析。結果：在低、中、高3個添加水平下，26種真菌毒素的平均加標回收率為80.1%～116.2%（n=5），平均回收率范圍為26種真菌毒素在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數（r2）≥0.99，檢出限和定量限分別為0.05～6.25 μg/kg和0.2～20.0 μg/kg。結論：該法簡單、快速、實用性強，適用于三七中26種真菌毒素的定量分析。

關鍵詞?QuEChERS;真菌毒素;超高效液相色譜-串聯質譜法;三七;同時測定;黃曲霉毒素;赭曲霉毒素;恩鐮孢菌素

Simultaneous Determination of 26 Mycotoxins in Notoginseng Radix et Rhizoma by QuEChERS-Ultra-High-performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Wang Shaomin1，Du Chunxiao1，Liu Xianxian1，Liu Guanping2，Mao Dan1，Liang Yunfei2，Huang Xiaojing1，Zhu Xiaofeng2，Chen Ke1，Ji Shen1

（1 Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China; 2 Guangxi Wuzhou Pharmaceutical（Group）Co.，Ltd，Wuzhou 543002，China）

Abstract?Objective：To establish a method for the simultaneous determination of 26 kinds of mycotoxins in traditional Chinese medicine Notoginseng Radix et Rhizoma using a QuEChERS pretreatment procedure coupled with ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UHPLC-MS/MS）.Methods：The samples were pretreated with QuEChERS method，extracted with 15% formic acid in acetonitrile，purified by mixed absorbents，as well as analyzed by UHPLC-MS/MS.Matrix-matched calibration curves and internal standards were used for accurate quantification.Results：Satisfactory recoveries at low，medium and high spiked levels were ranged from 80.1% to 116.2%（n=5）.Good linear relationships were obtained and the correlation coefficients（r2）were greater than 0.99.The limits of detection（LODs，S/N=3）and quantification（LOQs，S/N=10）ranged from 0.05 μg/kg to 6.25 μg/kg and from 0.2 μg/kg to 20.0 μg/kg，respectively.Conclusion：The proposed method is simple，rapid and valuable，which can be a powerful tool for quantitative analysis of the 26 mycotoxins in Notoginseng Radix et Rhizoma.

Key Words?QuEChERS; Mycotoxins; Ultra-High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Notoginseng Radix et Rhizoma; Simultaneous Determination; aflatoxins; Ochratoxins; Enniatins

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.003

近年來，中藥中真菌毒素安全性問題引起了國內外的高度重視。真菌毒素是真菌的有毒代謝產物，可通過直接攝取、吸入以及皮膚接觸進入人體及牲畜體內，引起嚴重的慢性毒性，包括肝、腎毒性、致癌性、致突變性及致畸性等。研究較多且感染范圍較廣的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮、單端孢霉烯族類等[1-2]，近年來新的真菌毒素種類也在不斷被發現，如恩鐮孢菌素類[3]。

目前單個或單類真菌毒素檢測方法較為成熟[4-5]，主要采用免疫親和凈化前處理方法聯合液相色譜或液質聯用檢測技術。而真菌毒素高通量檢測，由于不同真菌毒素產自不同真菌的代謝途徑，化學結構不同，理化性質差異大，且含量低，通常為μg/kg級別的痕量檢測，檢測難度較大。目前主要采用靈敏度高、專屬性強的液質聯用技術進行檢測，液相串聯三重四級桿質譜（LC-MS/MS）技術可采用多反應監測模式，通過采集母離子與對應子離子對，有效排除干擾，同時靈敏度高于其他全掃描高分辨質譜，是目前最常用的真菌毒素高通量檢測方法。前處理方面主要采用固相萃取柱、分散固相萃取方法進行凈化富集，其中QuEChERS方法以其多種凈化填料組合高效去除多種雜質，且操作簡便快速的特點，成為目前應用較多的方法。

目前高通量真菌毒素方法率先在食品領域中研究，研究基質多為食品與飼料[6-10]。近年來研究發現中藥在種植、加工、流通與貯存中均存在感染真菌毒素的風險。但中藥基質富含各種次生代謝產物，基質干擾更多，無法直接套用食品方法。三七是一味重要的傳統中藥，可“散瘀止血，消腫定痛”，既具縮短出血和凝血時間又兼具抗血小板凝聚和溶栓的作用，被臨床和日常保健大量應用[11-12]。但三七種植在溫暖潮濕的南方，在種植、貯存及運輸中易霉變，為進一步研究三七真菌毒素的安全性，本課題組以三七為基質，利用QuEChERS前處理技術[13]并進行改良，聯合液質技術首次建立了三七中26種真菌毒素檢測方法?？赏瑫r檢測黃曲霉毒素類、赭曲霉毒素類、伏馬毒素類、單端孢霉烯類、青霉素類及恩鐮孢菌素類多種真菌毒素，且操作簡便，準確，快速、為探索其他中藥基質中真菌毒素高通量檢測方法提供了借鑒。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（型號：Nexera X2-LCMS8060，供應商：日本島津公司）;高速離心機（型號：5810R，供應商：德國Eppendorf公司）;組織粉碎機（型號：Genogrinder 1500，美國SPEX公司）;氮吹儀（型號：N-EVAPTM-112，供應商：美國Organomation公司）;分析天平（型號：Statorius CP225D，供應商：美國梅特勒-托利多儀器有限公司）;Milli-Q純水儀（型號：Milli-Q，供應商：美國密理博公司），VA22MFD超聲儀（型號：VA22MFD，德國WIGGENS公司）。

1.2?試劑?甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨、醋酸銨（色譜純，購于德國Merck公司）;無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純，購于上海凌峰化學試劑有限公司），C18、GCB、PSA凈化填料均購于天津博納艾杰爾公司;真菌毒素標準品、同位素內標13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（1 mg/L）、13C18-玉米赤霉酮（1 mg/L）（純度均大于98%，均購于美國Sigma 公司）。

1.3?分析樣品?實驗用三七樣品分別取自廣西省百色市、云南省紅河自治州石屏縣三七種植基地各18批，依次編號為廣西01，廣西02……廣西18，云南01、云南02……云南18。

2?方法與結果

2.1?LC-MS/MS色譜質譜條件

色譜條件：采用粒徑為2.7 μm的安捷倫Poroshell 120 EC-C18的色譜柱（規格：150 mm×3.0 mm）;采用正負離子2種采集模式。正離子模式：流動性A相為甲醇，B相為0.5%甲酸-2 mmol/L甲酸銨水溶液，梯度洗脫條件：0～2 min：20% A，2～15 min：20%A～100% A;15～18 min：100% A;負離子模式：A相為乙腈，B相為水，梯度洗脫條件：0～2 min：10% A，2～15 min：10%B～100% A。流速0.45 mL/min，進樣量：5 μL。

質譜條件：ESI源，多反應監測模式（MRM），正、負2種模式進行掃描，相關參數為：離子源接口溫度：300 ℃，接口電壓：4 000 V，霧化氣流速：3.0 L/min;干燥氣流量：10.0 L/min，加熱氣流量：10.0 L/min;26種毒素的質譜參數見表1，總離子流圖見圖1。

2.2?對照品溶液的制備

取26種真菌毒素標準品，分別用乙腈稀釋成濃度為每1 L含100 mg的單個標準貯備液，再用乙腈配制成每1 L含1 mg的混合標準工作液。再取13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、13C18-玉米赤霉酮2種同位素內標標準品，用乙腈配制成質量濃度為每1 L含20 μg的混合內標標準工作液。

2.3?供試品溶液的制備

稱取三七粉末（過三號篩）約2 g，置50 mL離心管中，加入10 μL混合內標溶液，放置1 h待內標溶液揮干，加水15 mL放置5 min，加15%甲酸乙腈溶液10 mL勻漿2 min，加硫酸鎂氯化鈉混合鹽包5 g（4∶1），震搖30 min，離心，吸取上清液6 mL至離心管中，加入1.5 g混合凈化填料（GCB∶PSA∶C18∶MgSO4=30∶150∶300∶900），劇烈振搖5 min，離心，取上清液2 mL于40 ℃氮氣吹至約近干，加入20%甲醇溶液稀釋至1 mL，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.4?專屬性考察

取經預先測定，不含上述真菌毒素的三七樣品，按照“2.3”項下操作，制備空白供試品溶液;同時在樣品中添加“2.2”項下的混合標準工作溶液，按照“2.3”項下操作，制備加標供試品溶液。試驗結果表明，樣品中其他成分不干擾測定。

2.5?線性關系考察

取真菌毒素未污染的三七樣品，按供試品前處理方式制備空白基質溶液，將適量的26種真菌毒素標準貯備液和10 μL混合內標工作液混合，配制不同線性范圍的系列空白基質標準溶液，建立了26種真菌毒素的標準曲線，結果見表3。26種真菌毒素在線性范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均≥0.99。以定性通道的3倍信噪比（S/N）確定化合物的檢出限（LOD）、定量通道的10倍信噪比確定化合物的定量限（LOQ），檢出限和定量限分別為0.05～6.25 μg/kg和0.2～20.0 μg/kg。

2.6?中間精密度試驗?精密吸取混合對照品溶液5 μL，連續進樣6此，記錄峰面積及，結果各真菌毒素的峰面積相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7?供試品穩定性試驗

精密量取同一份添加濃度為25倍定量限的加樣回收試驗供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h進樣，測定峰面積，RSD均小于4.1%。試驗結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。

2.8?重復性實驗

采用加樣方法進行重復性試驗，按“2.8”項下制備添加濃度為20 μg/kg的瓜蔞皮和提取物供試品溶液，一式6份，進樣分析，26種真菌毒素的重復性結果（日內精密度）見表4。

2.9?回收率實驗

取各真菌毒素貯備液配制成混標（混標濃度根據26種毒素的定量限擴大25倍進行配制），分別以1倍、5倍和25倍定量限作為添加濃度進行回收實驗，分別在一天和連續的5 d進行回收實驗，26種生物毒素的平均回收率范圍為80.1%～116.2%，RSD范圍為0.2%～6.6%。見表4。

2.10?樣品測定結果

采用建立的UHPLC-MS/MS方法對36份三七樣品進行分析，樣品測定結果見表5。

3?討論

3.1?檢測真菌毒素種類的選擇

目標真菌毒素均為毒性大，食品和飼料中污染面廣，關注度高的真菌毒素。黃曲霉類毒素是目前發現的毒性最強的一類真菌毒素，具有強烈的致癌性，不僅造成嚴重的肝損傷，引發肝癌以外，也被發現會誘導腎癌、胰腺癌和結腸癌的產生[15]。赭曲霉類毒素具有多種慢性毒性，如致癌性、生長生殖毒性、神經毒性及免疫毒性等[16]。玉米赤霉烯酮類毒素最主要的毒性是生長生殖毒性，長期大劑量下攝入會致癌，并具有相對突出的免疫毒性[17]。同樣，T-2毒素、HT-2毒素、伏馬類毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇都是受到廣泛關注的真菌毒素[18-20]，糧谷中污染情況嚴重，國內外食品、藥品法規都相繼增加了相應的標準限度。桔青霉素急性毒性屬于高毒[21]，恩鐮孢菌素為近年來研究熱點，飼料中普遍檢出[2]。

3.2?色譜和質譜條件的優化

目標真菌毒素種類不同，理化性質差異較大，三七基質干擾不同。通過對每種真菌毒素通過質譜全掃描確定了采集模式，并通過比較2種模式下基質干擾情況，確定6種玉米赤霉烯酮類真菌毒素在負模式下采集，其他20種真菌毒素均在正離子模式下采集。

流動相系統比較了甲醇和乙腈2種有機相系統，結果顯示正離子模式下，甲醇系統中的基質干擾分離度優于乙腈系統，最終選擇甲醇作為正離子掃描模式流動相。為了改善離子化效率，提高分析靈敏度，比較了甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等改性劑，結果乙酸和乙酸銨表現不如甲酸和甲酸銨，而甲酸銨在較高濃度下（5 mmol/L）出現抑制離子化效率的現象。經試驗，在添加0.5%甲酸和2 mmol/L甲酸銨的情況下，甲酸用于提高電噴霧正模式下部分真菌毒素的離子化效率，添加甲酸銨可以改善峰形，抑制質譜電離中[M+K]+和[M+Na]+峰，獲得了最好的分離效果。在負離子模式下，采用乙腈流動相能改善峰形，在保證滿意的分離度前提下，縮短洗脫時間。最終，正離子模式下選擇0.5%甲酸，2 mmol/L甲酸銨水溶液及甲醇溶液作為流動相;負離子模式下，選擇水和乙腈作為流動相。

由于三七基質中存在較多皂苷類等大極性的干擾物質，梯度洗脫中先采用較大比例的水進行雜質干擾的去除，同時為保護質譜進樣環境，進樣前2分鐘采用廢液切換模式。

3.3?前處理條件優化

由于為痕量分析且同時分析多種不同種類的真菌毒素，需要完全提取真菌毒素同時盡量減少基質干擾，以達到準確分析的目的，需對前處理過程中的提取效率、凈化干擾雜質進行重點優化。QuEChERS方法是一種新型的通用型前處理方法，2003年發表運用在多種農藥殘留檢測前處理方法，該方法具有快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全以及回收率高的優點，可作為高通量真菌毒素檢測的前處理方法[22-24]。對提取和凈化操作中的提取方式、提取溶劑、凈化填料的組合和配比進行改良和優化。

3.3.1?提取方式?常規提取方式有超聲提取法、液液萃取法及震蕩提取法等，由于真菌毒素污染可同時出現在藥材表面與內部，研究中采用了勻漿法提取，可快速達到完全提取的目的。

3.3.2?提取溶劑優化

比較了乙腈和甲醇2種通用型提取溶劑，甲醇相對于乙腈具有較好的溶解度，而乙腈具有更好的選擇性，可以避免提取更多脂肪、色素等雜質，且乙腈的提取效率更好，因采用乙腈作為提取溶劑。

待測真菌毒素中伏馬菌素類、桔青霉素、赭曲霉毒素類等毒素具有羧基集團，水溶性強，對酸敏感性。常規乙腈水系統提取條件下，上述真菌毒素的回收率低于10%。故提取溶劑采用加入甲酸的方式，提高其穩定性，增加提取效率。通過對加入甲酸的濃度進行了考察，結果顯示隨著乙腈溶劑中甲酸濃度的提高，能夠使赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B和伏馬菌素回收率逐漸上升，說明提取溶劑酸度對于酸敏感性毒素的提取效率影響大，經研究，發現15%甲酸乙腈為最合適比例，各毒素的回收率均達到80%以上。

3.3.3?凈化填料優化

QuEChERS法常用凈化填料包括：十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳碳黑（GCB）和中性氧化鋁等?？疾熘邪l現中性氧化鋁對改善回收率無明顯影響。根據三七基質特點，本次研究中選擇PSA、GCB、MgSO4、C18作為凈化材料。經試驗，GCB雖有助于除去較多的色素，但其特殊的平面結構對玉米赤霉烯酮類毒素回收率影響大，故減小其使用量?？疾彀l現C18量不足或者過量時，HT-2，OTA及OTB的回收率為30%～60%;而PSA有助于除去脂肪酸等雜質，但過多PSA會對FB1、FB2以及FB3的回收率有一定的影響，確定PSA的最佳使用量均為150 mg，最終優化得到的填料配比為：GCB 30 mg，PSA150 mg，C18 300 mg，MgSO4 900 mg時，各真菌回收率均達到80%以上。

3.3?回收率與精密度?目標真菌毒素回收全部滿足80%～120%，相對偏低的主要為伏馬菌素類，在中、高濃度下的回收率相比低濃度下偏低，但仍達到80%以上。

3.4?基質效應?對樣品的基質效應進行了考察：比較真菌毒素的基質校正標準曲線的斜率與純溶劑配制的混合標準曲線的斜率，基質效應（%）=[（基質校正標準曲線斜率/混合標準曲線的斜率）-1]×100%。結果顯示大部分真菌毒素為基質抑制效應，少數真菌毒素如伏馬菌素類呈現基質增強效應。部分毒素的基質效應可達50%～80%。說明基質干擾明顯，主要是QuEChERS前處理為通用型前處理，雖能將目標真菌毒素全部提取，但同時提取的干擾物也非常多，盡管采用了混合填料凈化，但因為真菌毒素含量低，基質干擾仍較為明顯，因此必須采用基質校正標準曲線進行準確定量。

伏馬菌素類基質增強效應的原因可能是與真菌毒素共流出物中含有質子供體化合物，使得該類毒素均為基質增強效應。

3.5?三七檢測結果分析

2個省份種植基地生產的36批三七樣品中僅有3批樣品分別檢出恩鐮孢菌素B、B1和伏馬菌素B2，且檢出量均較低，約為1 μg/kg。美國2001年頒布的《工業指南：人類食物和動物飼料中伏馬菌素限值》規定玉米粉中伏馬菌素的限度為2 000 μg/kg，歐盟頒布的食品中真菌毒素限量標準（EC）No.1881/2006中規定伏馬菌素的限度為1 000 μg/kg。與該限度比較，三七中檢出的伏馬菌素B2遠遠低于參考限度。

有關恩鐮孢菌素B、B1的毒性研究目前尚不成熟，目前研究發現是恩鐮孢菌素具有細胞毒性;但需要但同時也發現恩鐮孢菌素具有殺菌抗炎的功效，一定程度上屬于抗菌素和抗生素[25-27]。體外細胞實驗表明ENNB體外對肝細胞毒性大[29-30]，但仍需進一步體內實驗的驗證。因此目前尚不能說明三七檢出恩鐮孢菌素B、B1是否具有一定的風險。待將來恩鐮孢菌素毒性研究深入后再進一步評價。

本次研究采用改良QuEChERS前處理技術，建立了UHPLC-MS/MS同時檢測三七中26種真菌毒素的方法?？煽焖偻瓿芍兴幦咧?6種常見真菌毒素的定性和定量分析，具有操作簡單、實用性強的特點，也為其他中藥基質中多種真菌毒素含量的同時檢測提供技術借鑒。

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