基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜技術的黃芪注射液中化學成分分析

于泓　胡青　孫健　馮睿　張甦　張靜嫻　毛秀紅　季申

摘要?目的：基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（Ultra-performance Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-flight Mass Spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS）對黃芪注射液物質基礎進行了全面的研究，建立及黃芪注射液中有關成分的快速準確的分析方法。方法：采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×100 mm，1.8 μm），以含0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，流速0.4 mL/min;電噴霧源（ESI），Q-TOF-MS作檢測器，正、負離子模式檢測;甲醇稀釋樣品;與對照品保留時間、母離子及碎片離子精確分子量，比對準確定性。結果：共鑒定黃芪注射液中的46個化合物，包括氨基酸，黃酮，皂苷，核苷和煙酸等。結論：建立了黃芪注射液中的復雜化學成分的快速檢測和評價方法，為其的質量控制及工藝改進提供參考。

關鍵詞?黃芪注射液;黃芪;化學成分;Q-TOF-MS;皂苷;黃酮;氨基酸;核苷

Comprehensive Screening of Multi-components in Huangqi Injection by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-time-of-flight Mass Spectrometry

Yu Hong，Hu Qing，Sun Jian，Feng Rui，Zhang Su，Zhang Jingxian，Mao Xiuhong，Ji Shen

（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract?Objective：To study comprehensive screening multi-components in Radix Astragali and Huangqi injection，based on high-resolution quadrupole-time-of-flight mass spectrometry.Methods：The analysis was performed by Agilent Eclipse Plus C18 column（3 mm × 100 mm，1.8 μm）with the mixture of 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile as mobile phase by gradient elution，and the flow rate was 0.4 mL/min.Q-TOF-MS equipped with ESI ion source was performed in both positive and negative ionization.Samples were diluted with methanol.Qualitative analyze was based on retention time，the accurate mass of the precursor ion and product ions.Results：A total of 46 components including amino acids，flavonoids，saponins，nucleosides and nicotinic acid were successfully identified or tentatively characterized.Conclusion：This study is expected to provide an effective pattern for systematic characterization of the complex Huangqi injection systems，and establish a reliable strategy for its quality evaluation，also offers a reference for quality control as well as technological improvement.

Key Words?Huangqi injection; Radix Astragali; Components; Quadrupole-time-of-flight mass spectrometry; Saponins; Flavonoids; Amino acids; Nucleosides

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.005

黃芪注射液是我國較早開發的中藥注射液品種之一，是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪干燥根的水提滅菌溶液，具有廣泛的藥理作用。皂苷類、黃酮類、氨基酸類成分為其功效的主要物質基礎[1]。具有益氣養元，扶正祛邪，養心通脈，健脾利濕的功效。廣泛應用于心氣虛損，血脈瘀阻之病毒性心肌炎[2]，心腦血管疾病[3-4]及腎臟疾病[5]等。急性毒性試驗、長期毒性試驗[6]以及臨床研究均表明：黃芪注射液效果確切，不良反應較少[7]，是具有研究和開發價值的中藥注射劑品種[8]。為了提高黃芪注射液的質量，降低不良反應發生概率，亟待對其化學成分進行深入研究。

成分的復雜和缺乏對照品，是中藥及天然產物分析的共同難題。液相色譜串聯高分辨率質譜（UPLC/Q-TOF-MS），且具有較高的選擇性和靈敏度，近年來也常被用于中藥和天然藥物的成分分析[9-12]。可實現非目標的成分分析模式[13-14]，利于未知化合物的發現和鑒定。

本研究采用超高效液相串聯四級桿飛行時間質譜，根據精確分子量和碎片離子信息，并結合相關文獻數據[15]，鑒定了46種化合物，其中24種已通過對照品確證。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

Agilent 1290 Infinity高效液相色譜儀，Agilent 6550 Q-TOF質譜儀（美國Agilent公司），Sartorius MSU225P-1CE-DU分析天平（德國Sartorius公司），超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）。甲醇、鹽酸和乙酸乙酯為分析純試劑（上海凌峰化學試劑有限公司）;質譜用水和乙腈為LC-MS級試劑（德國Merck公司），甲酸為色譜純試劑（德國Merck公司）;質譜所用參比液，調諧液均為美國Agilent公司提供。

1.2?試劑

標準對照品：蘇氨酸（Threonine，A2），谷氨酸（Glutamic acid，A3），脯氨酸（Proline，A4），纈氨酸（Valine，A5），L-異亮氨酸（L-isoleucine，A6），酪氨酸（Tyrosine，A7），L-亮氨酸（L-Leucine，A8），苯丙氨酸（Phenylalanine，A8），胸腺嘧啶脫氧核苷（Thymidine，A9），色氨酸（Tryptophan，A10），煙酸（Nicotinic acid，O1），尿苷（Uridine，O2），腺苷（Adenosine，O3），毛蕊異黃酮-7-葡糖苷（Calycosin-7-glucoside，F4），染料木苷（Genistin，F6），芒柄花苷（Ononin，F9），毛蕊異黃酮（Calycosin，F12），芒柄花素（Formononetin，F14），黃芪甲苷（Astragaloside IV，S6）均購于中國藥品生物制品檢定所。Methylnissolin 3-O-glucosid（F10），黃芪皂苷I（Astragaloside I，S14），黃芪皂苷II（astragaloside II，S8），環黃芪醇（Cycloastragenol，S17）和黃芪皂苷III（astragaloside III，S7）購于上海同田生化技術有限公司。

黃芪注射液分別由6家生產廠家提供。1 mL注射劑分別相當于2 g黃芪。其中樣品A1和A2工藝中使用增溶劑;樣品B1，B2，B3和B4不添加任何增溶劑。

1.3?分析樣品

黃芪注射液樣品以甲醇稀釋10倍和100倍（v/v）。在14 000 r/min離心10 min后將上清液轉移到自動進樣器小瓶中進行分析。標準儲備溶液以甲醇制備，-4 ℃儲存。

1.4?UPLC條件

Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（3 mm×100 mm，1.8 μm）;柱溫：30 ℃;進樣體積：2 μL;流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脫程序：0～2 min：3% B;3～17 min：3%～70% B;18～22 min：95% B;23～25 min：3% B。流速：0.4 mL/min。

1.5?Q-TOF-MS條件

質譜條件：采集模式：正模式;掃描范圍：m/z 70～1 300.離子源參數：霧化氣（N2）：35 psi;干燥氣（N2）：流速15 L/min，溫度200 ℃;鞘氣（N2）：流速12 L/min，溫度350 ℃;毛細管電壓3.5 kV;碎裂電壓250 V;CID電壓：5～40 eV;參比離子：正模式：m/z121和922;負模式：m/z 112和1 033。碰撞誘導解離（CID），能量從6～70 eV，每個化合物單獨優化。

1.6?數據分析

通過文獻檢索，建立包含可能存在的近200個蒙古黃芪和膜莢黃芪藥材中所含成分的初級譜庫[15-17]，數據庫通過MassHunter PCDL Manager軟件建立，包含化合物名稱，精確分子量，分子式，分子結構。采集的數據文件通過Agilent′s MassHunter Qualitative軟件與譜庫進行匹配分析。

通過精確分子量匹配（<1 ppm），根據其可能的的化學結構將化合物分類。通過碰撞誘導解離（CID）得到二級譜信息，盡可能減少對化合物的誤判。對于對照品可能獲得的化合物，通過與標準品保留時間，二級譜匹配等信息進一步確定。對于難以獲得標準品的化合物通過二級光譜與文獻報道的離子碎片等進行比對。

2?結果與討論

2.1?UPLC/Q-TOF-MS的共有化合物的分析結果

分別在正負2種模式下采集，黃芪注射液中共鑒定出46個共有化合物（圖2）。根據化學結構將46種組分分為4組：氨基酸（A），黃酮類（F），皂苷（S）和其他（O）。表2為46化合物的主要碎片譜峰歸屬。

2.2?主要黃酮化合物的鑒定

17種黃酮類化合物分屬于4種黃酮結構類型：黃酮，異黃酮，異黃烷以及紫檀烷類。二級譜質譜圖中，可見丟失CH3，CO（C-4），CHO（C-OH）和脫H2O（3-OH，5-OH或m-OH，o-OH）的碎片離子。通過黃酮類C環的逆Diels-Alder（RDA）裂解，得到關于A環和B環中取代基的數量和類型的信息。

圖1a和圖1d顯示了峰F14的一系列碎片離子（m/z 269.0808）解析機理如圖所示。黃酮苷類結構較為脆弱，容易在低碰撞電壓下裂解甚至在ESI離子源內碎裂，因此會同時產生苷和苷元的“[M+H]+”。因此可將黃酮苷元及糖苷進行分類分析，例如：圖1中F9和F14的結構解析過程。F9（m/z 431.132 7）保留時間9.8 min。在低碰撞電壓（<10 eV）下質譜相對簡單，僅含有一個子離子，m/z為269.0801，與峰值F14相同（圖1b）。當碰撞電壓增加到60V時，F9的二級質譜顯示與F14非常相似，說明F9可能在結構上與F14相似。F9比F14分子量多162 Da，推導F9可能是芒柄花苷（Ononin），并用對照品進一步確認了保留時間和質譜數據。使用上述方法又繼續鑒定了另外3對類黃酮及其糖苷（F4和F12，F5和F13，F10和F15）。F1和F2具有相似的二級質譜圖，且F1比F2分子量多162 Da（C6H10O6）。推測具相同苷元的不同異黃酮糖苷。

在研究中發現，黃酮類有幾組同分異構體，如F2和F8（C22H22O11，m/z 463.123 5）。在數據庫中，得到3個候選化合物：紅車軸草素7-O-葡萄糖苷（pratensein 7-O-glucoside），鼠李糖苷3-O-葡糖苷（rhamnocitin 3-O-glucoside）和山柰素3-O-葡萄糖苷（kaempferide 3-O-glucoside）。[M+H]-離子的二級質譜顯示它們都具有分子量301.070 6（C16H13O6）的苷元碎片離子。峰F8在RDA機理中斷裂的m/z 153和134碎片表明它在A環和B環中皆含有2個羥基官能團，所以紅車軸草素7-O-葡糖苷是唯一的結果。

參考文獻[18]，F2可鑒定為鼠李糖苷3-O-葡糖苷。F3和F4具有非常相似的結構，將保留時間與對照品進行比較，確認F4為毛蕊異黃酮-7-O-葡萄糖苷（calycosin-7-O-glucoside），而F3可能為3′-hydroxy-5′-methoxyisoflavone-7-O-glucoside。

2.3?主要皂苷類化合物的鑒定

黃芪中大部分皂苷類成分均屬于C-17位帶有一個呋喃環的環阿屯烷型四環三萜皂苷。通常情況下，環阿屯烷類皂苷在0.1%甲酸-乙腈系統中，正模式下具有顯著的[M+Na]+和較低豐度的[M+H]+;或者負模式下顯著的[M+COOH]-。另外，皂苷類結構在ESI+模式下特征顯著，由于其母離子在離子源內容易碎裂，即使在較為溫和的條件下，質譜圖上也會表現為一簇一簇的碎片離子[15]。而此類皂苷類結構的質譜行為恰好可以作為一個快速識別及判斷環阿屯型皂苷類結構存在的方法。本研究中，皂苷類結構出峰時間在11分鐘以后，其結構分析采用正負2種模式下分別采集質譜信息相結合分析。

以黃芪甲苷IV（S4，Astragaloside IV）為代表的皂苷類成分，質譜中碎裂特征明顯。圖2所示正模式的質譜圖上出現規律的成簇的復雜離子信號，低碰撞能量的二級譜與之幾乎相同。A組中為母離子及其一系列脫水離子信號;B組中為母離子脫去C-6葡萄糖或者C-3木糖，以及其一系列的脫水離子信號;C和D組幾乎可以在所有以環黃芪醇m/z 437.341 4（C30H45O2）為苷元的黃芪皂苷中觀察到的一組信號，其中C組包含苷元離子碎片以及其一系列脫水離子的信號;D組主要為2個環黃芪醇骨架的特征離子碎片m/z 143.106 7（C8H15O2）和125.096 6（C8H13O），是C-17和C-20之間斷裂產生的呋喃環的離子碎片。另外，采集負模式下的[M+COOH]-離子的二級譜，可以獲得苷元離子碎片489.357 7（C30H50O5，），以及脫木糖的[M-H-xyl]-離子碎片 m/z 651.412 3（C36H59O10）。一般皂苷C-3位的苷鍵較C-6位容易斷裂[19]。從而可以區別與黃芪甲苷為同分異構體的黃芪皂苷III（S7）。

同類型皂苷分析發現，環阿屯型皂苷的質譜行為具有極強的規律性，具有相同苷元骨架，且裂解途徑相同。通過正負模式下綜合分析，可以基本確認環阿屯型皂苷存在。正模式下，即可通過其離子源內裂解產生的成簇存在的碎片離子;以及通過提取特征碎片離子m/z 437.341 4，143.106 7和125.096 6快速的定位以及辨認環阿屯型皂苷。如圖3所示，通過提取特征離子437.3414可以定位大部分環阿屯型皂苷。而負模式下采集的二級譜信息，可以提供皂苷上糖連接位置以及類型的信息。通過上述方法綜合分析，本研究在黃芪注射液中中共分析得到16個環阿屯型皂苷和一個齊墩果烷型皂苷，其中5個化合物與標準品確證。

此外，我們還觀察到實驗中異構體的相互轉化（S6和S7;S8，S12和S13;S14，S15和S16）。在室溫下儲存數小時后，對照品溶液中發生異構化現象（圖4）：S7部分轉化為S6;S8轉換為S12，S13;并且S14轉換為S15，S16。異構體通常在黃芪注射液中共存，其不穩定性可能是由糖苷鍵或乙酰基的異構化或分子構型的變化引起的。并且實驗中發現甲醇溶液提取黃芪皂苷可以抑制異構現象的發生，而水溶液提取黃芪皂苷時會促進異構現象發生。

2.4?氨基酸及其他化合物的鑒定

基酸類成分在反柱上一般難以保留和分離。使用高分辨率質譜可將氨基酸類成分從復雜的背景信號中提取出來，但由于基質效應影響嚴重并不能很好的識別和鑒定。本研究中共分析得到10種氨基酸化合物。通常氨基酸類成分在甲酸系統正模式下表現為較強的[M+H]+，二級譜中主要以[M+H-COOH]+或[M+H-NH3]+離子碎片為主。其中9個化合物與對照品保留時間以及質譜相關信息確證。

黃芪注射液中還存在煙酸（O1），尿嘧啶（O2），和腺苷（O3）。均與標準品比對，確證。另外，O4（C10H14N2O5）在黃芪相關文獻中并未發現相關信息，其分子式與胸苷一致，但碎片離子與胸苷標準品不一致。

3?結論

本研究中采用UPLC/Q-TOF/MS法，研究建立了黃芪注射液快速準確成分分析方法。在研究方法條件下，在6個廠家注射液中共分析得到46個共有化合物，其中24個已通過標準品驗證。研究中還歸納了不同類型化合物質譜裂解規律，為同類型化合物成分分析提供參考。

基于成分分析結果，發現6廠家黃芪注射液產品質量非常大。除黃芪藥材質量的影響因素外，各廠家生產工藝不同，應該是注射液產品質量影響的主要因素。因此，統一黃芪注射液生產工藝是非常必要的。另外添加增溶劑，可以極大的改善黃芪甲苷等皂苷類成分的含量，但注射液中使用吐溫80等增溶劑存在一定風險[20]。另外在研究中發現，部分環阿屯烷型皂苷在水溶液中的異構現象;對黃芪注射液工藝改進具指導意義。

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