蠐螬提取物對視網膜靜脈阻塞兔 內皮抑素表達的影響

梁凱霞 蔣鵬飛 彭俊 彭清華

〔摘要〕 目的 評價蠐螬提取物對兔視網膜靜脈阻塞的治療作用及其機制。方法 將40只兔隨機分為4組：空白組、模型組、復方血栓通組、蠐螬組，每組10只兔20只眼，除空白組外，其余3組均用光化學動力法建立視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion， RVO）動物模型，于給藥后1周、3周行FFA檢查、HE染色、免疫組化觀察內皮抑素表達。結果 FFA檢查結果顯示：給藥后周1周，模型組中央靜脈熒光滲漏、出血，復方血栓通組和蠐螬組滲漏、出血較模型組少;給藥后3周，模型組滲漏、出血的靜脈周圍出現無灌注區，復方血栓通組滲漏、出血明顯減小，蠐螬組滲漏、出血基本吸收。視網膜切片光鏡觀察結果顯示：蠐螬組視網膜各層結構病理變化均輕于模型組、復方血栓通組。內皮抑素免疫組化結果顯示：各造模組內皮抑素表達均下降，蠐螬組表達最強，模型組表達最弱，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 蠐螬提取物能改善視網膜缺血缺氧的狀態，促進RVO模型中內皮抑素的表達。

〔關鍵詞〕 視網膜靜脈阻塞;蠐螬提取物;內皮抑素

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.005

Effect of Grub Extract on the Expression of Endostatin in Rabbits with Retinal Vein Occlusion

LIANG Kaixia1，2， JIANG Pengfei1，2， PENG Jun2，3， PENG Qinghua1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To evaluate the therapeutic effect and mechanism of action of grub extract on rabbits with retinal vein occlusion （RVO）. Methods Forty rabbits were randomly and equally divided into blank group， model group， compound Xueshuantong group， and grub group， with 20 eyes in each group. A rabbit model of RVO was established by a photochemical kinetic method in all groups except for the blank group. Fluorescein fundus angiography （FFA）， HE staining， and immunohistochemistry （for measuring endostatin expression） were performed at 1 and 3 weeks after treatment. Results According to the FFA results， at 1 week after treatment， central venous fluorescence leakage and hemorrhage were observed in the model group; the compound Xueshuantong group and grub group had less leakage and hemorrhage than the model group. At 3 weeks after treatment， areas of non-perfusion showed up around the vein with leakage and hemorrhage in the model group; the compound Xueshuantong group had substantially reduced leakage and hemorrhage; the leakage and hemorrhage were almost absorbed in the grub group. The results of optical microscopic examination of retinal sections showed that the grub group had less pathological changes in each retina layer than the model group and the compound Xueshuantong group. According to the immunohistochemistry results， the expression of endostatin was significantly reduced in all three model establishment groups; among the three groups， the grub group had the highest expression of endostatin， while the model group had the lowest expression （P<0.05）. Conclusion Grub extract can improve retinal ischemia and hypoxia and promote the expression of endostatin in the rabbit model of RVO.

〔Keywords〕 retinal vein occlusion; grub extract; endostatin

視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion， RVO） 是臨床上常見的眼底血管病，其病因復雜，一般認為高血壓、高血脂、青光眼、糖尿病以及動脈硬化等都是高危因素[1]。RVO病程冗長，治療困難，尚無特效療法，RVO后視網膜組織會發生缺血缺氧，視網膜新生血管（retinal neovascularization， RNV）是RVO的常見并發癥。蠐螬可治療目疾，并有破血、行瘀、散結、明目之功效，前期研究發現蠐螬提取物可促進RVO出血的吸收、抑制RNV[2-3]，為明確其機制，本文通過建立RVO動物模型，探討蠐螬對RNV的作用機制，為研究RVO和RNV的治療提供方向。

1 材料

1.1? 實驗動物

選用40只健康實驗性兔，雌雄兼用，體質量1.8～2.3 kg（合格證號：湘醫動字第30-015號）。

1.2? 主要藥品和試劑

蠐螬提取物，制備參考陽長明的方法[4]。復方血栓通片（揚州中惠制藥有限公司，規格：0.40 g×24片，批號090905）;25%烏拉坦（上海伊卡生物技術有限公司，批號：U0202）;20%熒光素鈉（沈陽晟達化工有限公司，批號：SS00050）;一抗為兔抗內皮抑素多克隆抗體（武漢默沙克生物科技有限公司，批號：BA21646）。

1.3? 主要儀器

JY0001型電子秤（上海天平儀器廠）;ZDS-10型勒克斯照度計（上海嘉定學聯儀器廠）;YZZOT型顯微鏡（蘇州醫療器械設備廠）;PCR儀（德國Biometra）;GelDoc XR+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）;微量移液器（德國，eppendorf[1 mL/200 uL/10 uL）];臺式高速冷凍離心機（Thermo）;DYCZ-24D垂直板電泳槽、DYCP-40C水平電轉槽（北京六一儀器廠）;SP-752型紫外可見分光光度計（上海spectrum公司）。

2 方法

2.1? 動物分組

通過隨機數字表法將40只實驗性兔隨機分為空白組、模型組、復方血栓通組、蠐螬組，每組10只動物，20只眼。

2.2? 造模方法

應用光化學動力法[5]制作實驗性RVO模型，模型組、復方血栓通組、蠐螬組雙眼散瞳后，麻醉動物，固定兔于裂隙燈前，安置三面鏡。激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后，自耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液（0.3 mL/kg），30 s內推完。在注藥后，用倍頻Nd：YAG激光對雙側視網膜靜脈進行照射，同時避開伴行的動脈，看到有明顯的遠端靜脈擴張時停止。

2.3? 動物給藥方法

造模成功后第1天開始給藥，空白組、模型組生理鹽水5 mL/kg灌胃;復方血栓通組：復方血栓通0.1 g/kg溶于生理鹽水中制成混懸劑，5 mL/kg灌胃;蠐螬組：蠐螬水提取物1.5 mL/kg灌胃，其中1 mL水提物相當于1 g生藥量。各組均為每日1次，持續3周，于給藥后1周、3周每組各隨機處死5只動物。

2.4? 取材方法

動物耳緣靜脈注射空氣處死后，立即摘除眼球（包括球后視神經2 mm），于角膜緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節組織和玻璃體，將眼球壁在手術顯微鏡下剝離激光斑部位視網膜，逐級酒精脫水，常規石蠟包埋，經視乳頭顏側旁開1 mm縱向做4 μm厚的切片，烘干備用。

2.5? 熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiograpny， FFA）

給藥后1周、3周對兔行FFA檢查，將1周和3周的FFA結果，應用Mias-2000型顯微圖像分析系統自動測量無灌注區（non perfusion area， NPA）和視盤（optic disk， OD）的面積并求出比值（S=N/D）[6]。分為有無灌注區、無新生血管（甲類）和有無灌注區、有新生血管（乙類）。

2.6? 光鏡觀察

將取材的切片行蘇木精-伊紅染色，做免疫組化組織學檢測內皮抑素表達：于40×目鏡下觀察，每張切片均選取免疫組化陽性染色最多的4個視野框，用Mias-2000圖形分析系統行視網膜色素上皮以上測量框內染成棕黃色的ES的平均光密度，在光學顯微鏡下主要觀察視網膜組織變化。

2.7? 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行分析。多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗（S-N-K法），組內不同時間點比較采用重復測量資料的方差分析，相關性分析用Bivariate分析。各項指標均以“x±s”表示。P<0.05被認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1? FFA檢查結果

給藥后1周，模型組中央靜脈熒光滲漏、出血，復方血栓通組、蠐螬組滲漏、出血較模型組少（P<0.05）;給藥后3周，模型組滲漏、出血的靜脈周圍出現無灌注區，復方血栓通組滲漏、出血明顯減小，蠐螬組與模型組相比，滲漏、出血基本吸收，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

3.2? HE染色結果

空白組：視網膜各層結構清晰，排列正常。模型組：給藥后1周，視網膜組織水腫，細胞排列較亂，尚無新生血管索;給藥后3周，出現大量地新生血管索。復方血栓通組：給藥后1周，視網膜組織水腫，細胞排列紊亂;給藥后3周，視網膜組織水腫減輕，無新生血管索。蠐螬組：給藥后1周，視網膜組織細胞排列大致清晰;給藥后3周，視網膜組織水腫減輕，無新生血管索。見圖1。

3.3? 內皮抑素的陽性表達結果

與空白組比較，模型組內皮抑素表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。給藥后第1周：模型組、復方血栓通組、蠐螬組視網膜組織中均可見棕色顆粒狀染色，其中蠐螬組內皮抑素表達最強，模型組內皮抑素表達最弱，差異有統計學意義（P<0.05）;給藥后3周：蠐螬組視網膜組織中內皮抑素表達最強;復方血栓通組內皮抑素表達均較蠐螬組稍弱;蠐螬提取物組3周與1周比較，內皮抑素表達明顯減弱（P<0.05）。見表2。

4 討論

RVO發病率高，是僅次于糖尿病視網膜病變的第二大致盲性視網膜血管病[7-9]，其發生機制目前尚不明了[10-13]。

蠐螬是金龜子的幼蟲，首次記載于《神農本草經》：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚，青翳白膜。”《本草綱目》中記載此藥味咸微溫，有破血、行瘀、散結、通乳、解毒、消瘡、明目的功能?，F代藥理研究認為蠐螬對視網膜靜脈阻塞的缺血視網膜組織有保護作用[2-3]，能夠治療RVO所致的視網膜病理損傷。

內皮抑素是內源性血管生成抑制因子[14]，能夠特異性的抑制血管內皮細胞增殖、遷移和凋亡。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進血管內皮細胞分裂，通過與膜受體結合特異性調節內皮細胞增殖，促進新生血管生成[15]，視網膜新生血管是視網膜靜脈阻塞的主要并發癥之一，影響著視網膜靜脈阻塞的治療與預后。內皮抑素可競爭性抑制VEGF與其膜受體的結合，阻斷VEGF受體活化的信號轉導通路，抑制VEGF介導的血管內皮細胞遷移和新生血管的形成。

本研究結果顯示：模型組內皮抑素陽性表達高于空白組，二者差異有統計學意義。據此推斷，光化學法建立RVO模型產生的RNV，其發生機制與內皮抑素密切相關，復方血栓通治療組、蠐螬提取物治療組的內皮抑素較模型組均有增多，提示復方血栓通治療組、蠐螬提取物治療組是通過上調內皮抑素的表達抑制血管內皮生長因子在視網膜組織中的表達，從而抑制了RNV的發生。

參考文獻

[1] 何茂秋，董? 玉.視網膜靜脈阻塞的中西醫治療進展[J].云南中醫中藥雜志，2018，39（10）：70-72.

[2] 邱曉星，彭清華，陳? 梅，等.蠐螬提取物對兔脈絡膜新生血管中Ang1和PEDF表達的影響[J].國際眼科雜志，2012，12（11）：2053-2058.

[3] 張波濤，彭清華，葉群如，等.蠐螬提取物對兔視網膜靜脈阻塞模型視網膜組織ET-1表達的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2012， 32（9）： 8-11.

[4] 陽長明，侯世祥，羅英杰，等.蠐螬滴眼液中氨基酸成分的測定[J].湖南中醫雜志，2001，32（1）：57-59.

[5] 陳立軍，王雨生.“二步法”激光誘導脈絡膜視網膜靜脈吻合術治療兔視網膜中央靜脈阻塞的視覺電生理變化[J].眼科新進展，2006，26（4）：253-256.

[6] 唐? 坤，李素芬.視網膜分支靜脈阻塞無灌注區范圍、視野閾值與新生血管關系的研究[J].國際眼科雜志，2009，9（6）：15-16.

[7] WOLF-SCHNURRBUSCH U E K. Retinal vein occlusion[M]//Spectral domain optical coherence tomography in macular diseases. Springer， New Delhi， 2017：147-150.

[8] GOLDENBERG D， LOEWENSTEIN A. Retinal Vein Occlusion[M]//Medical Retina. Karger Publishers， 2017，9：32-41.

[9] JONAS J B， MON？魪S J， GLACET-BERNARD A， et al. Retinal vein occlusions[M]//Macular Edema. Karger Publishers， 2017， 58：139-167.

[10] STARR M R， NORBY S M， SCOTT J P， et al. Acute retinal vein occlusion and cystic fibrosis[J]. International Journal of Retina and Vitreous， 2018， 4（1）： 26-37.

[11] PRAJAPATI V A， VASAVADA D， PATEL S M， et al. A study of evaluation of various risk factors of retinal vein occlusion[J]. International Journal of Research in Medical Sciences， 2017， 2（3）： 1054-1057.

[12] BUCCIARELLI P， PASSAMONTI S M， GIANNIELLO F， et al. Thrombophilic and cardiovascular risk factors for retinal vein occlusion[J]. European Journal of Internal Medicine， 2017， 44： 44-48.

[13] WINEGARNER A， WAKABAYASHI T， HARA-UENO C， et al. Retinal microvasculature and visual acuity after intravitreal aflibercept in eyes with central retinal vein occlusion： an optical coherence tomography angiography study[J]. Retina， 2018， 38（10）：2067-2072.

[14] STANSBOROUGH R L， BATEMAN E H， AL-DASOOQI N， et al. Vascular endothelial growth factor （VEGF）， transforming growth factor beta （TGFβ）， angiostatin， and endostatin are increased in radiotherapy-induced gastrointestinal toxicity[J]. International Journal of Radiation Biology， 2018，94（7）：645-655.

[15] ZHU Y， SUN L， ZHANG H， et al. Effects of isorhamnetin on protein expression of VEGF， MMP-2 and Endostatin in Lewis lung cancer mouse[J]. International Journal of Clinical and Experimental Medicine， 2017，10（8）：11488-11495.