澤瀉湯加味方對鹽敏感性HBZY21細胞中 AngII-NADPH-ROS信號通路的影響

崔海鵬 劉玉玲 劉凱 孫曉旭 王途 趙娟 張樹峰

〔摘要〕 目的 探討澤瀉湯加味方對鹽敏感性腎小球系膜細胞中AngII-NADPH-ROS信號通路的作用機制。方法 采用高鹽和AngII誘導大鼠腎小球系膜細胞的方法建立鹽敏感性高血壓體外細胞模型，設正常組、模型組、陽性藥纈沙坦組、澤瀉湯加味方（高、中、低劑量）組。CKK-8法測定細胞活性;RT-qPCR方法檢測細胞中Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達水平;Western blot方法檢測細胞中AT1R、P22、P47、NOX4的蛋白質表達水平;活性氧檢測試劑盒檢測細胞中ROS水平。結果 與正常組比較，模型組細胞中Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達水平、AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達水平以及ROS表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及澤瀉湯加味方中劑量組Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達水平、AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達水平以及ROS表達水平顯著降低（P<0.05）。不同濃度澤瀉湯加味方組間，中劑量組對AngII-NADPH-ROS信號通路的下調作用最為明顯。結論 澤瀉湯加味方對鹽敏感性高血壓腎損害的保護作用可能與抑制AngII-NADPH-ROS信號通路有關。

〔關鍵詞〕 鹽敏感性高血壓;腎損傷;澤瀉湯;血管緊張素II;AngII-NADPH-ROS信號通路

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.010

Impact of Modified Zexie Decoction on the AngII-NADPH-ROS Signaling

Pathway in Salt-Sensitive HBZY21 cells

CUI Haipeng， LIU Yuling， LIU Kai， SUN Xiaoxu， WANG Tu， ZHAO Juan， ZHANG Shufeng*

（Chengde Medical College， Chengde， Hebei 067000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of modified Zexie Decoction on the angiotensin II （AngII）-NADPH-reactive oxygen species （ROS） signaling pathway in salt-sensitive glomerular mesangial cells. Methods An in vitro cell model of salt-sensitive hypertension was established by inducing rat glomerular mesangial cells with high salt and AngII. Cells were divided into normal group， model group， positive valsartan group， and high-， medium-， and low-dose modified Zexie Decoction groups. CKK-8 assay was used to determine the cell viability. RT-PCR was used to determine the mRNA expression levels of Agtr1a， Cyba， and NOX4. Western blot was used to determine the protein expression levels of AT1R， P22， P47， and NOX4 in cells. The ROS levels in cells were measured by a ROS assay kit. Results Compared with the normal group， the model group had significantly higher mRNA levels of Agtr1a， Cyba， NOX4， protein levels of AT1R， P22， P47， and NOX4， and ROS levels （P<0.05）. Compared with the model group， the valsartan group and the medium-dose modified Zexie Decoction group had significantly lower mRNA levels of Agtr1a， Cyba， and NOX4， protein levels of AT1R， P22， P47， and NOX4， and ROS levels （P<0.05）. Among the three modified Zexie Decoction groups， the medium-dose group had the greatest downregulation of the AngII-NADPH-ROS signaling pathway. Conclusion The protective effect of modified Zexie Decoction against renal injury induced by salt-sensitive hypertension might relate to the inhibition of the AngII-NADPH-ROS signaling pathway.

〔Keywords〕 salt-sensitive hypertension; renal injury; Zexie Decoction; angiotension II; AngII-NADPH-ROS signaling pathway

鹽敏感性高血壓作為最常見的繼發性高血壓，嚴重威脅人類健康[1]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin angiotensin aldosterone system， RAAS）相關的信號通路轉導分子（AngII-NADPH-ROS信號通路）異常被認為是鹽敏感性高血壓發生的重要機制之一[2-4]。越來越多的研究表明，中醫藥治療鹽敏感性高血壓，具有獨特優勢[5-6]，前期研究證實，澤瀉湯加味方在臨床治療鹽敏感性高血壓效果明顯[7]，動物實驗表明，澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠腎臟有明顯的保護作用[8-9]。然而缺少運用科學實驗方法對澤瀉湯加味方治療鹽敏感性高血壓作用及機制的實驗研究。本文以鹽敏感性高血壓細胞模型作為研究對象，初步研究了澤瀉湯加味方對RAAS相關信號通路AngII-NADPH-ROS信號通路的影響，為進一步將澤瀉湯加味方研發成高效、安全的治療鹽敏感性高血壓的新型降壓藥物提供可靠的實驗依據。

1 材料

1.1? 藥物

澤瀉湯加味方：澤瀉（批號0171422112）、白術（批號160180101）、澤蘭（批號512150401）、石菖蒲（批號170630），由承德醫藥集團責任有限公司提供;纈沙坦膠囊（批號X0796）購于北京諾華制藥有限公司。

1.2? 細胞株

大鼠腎小球系膜細胞株：HBZY21（武漢大學中國典型培養物保藏中心）。

1.3? 主要試劑

DMEM-H（美國Hyclone公司）;胎牛血清（美國Sigma公司）;Trizol裂解液、RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒、活性氧檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）;TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix SYBR Green熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）;兔抗大鼠AT1R、P22、NOX4（Abcam公司）;P47（Santa公司）;兔抗大鼠β-actin抗體、HRP標記山羊抗兔二抗（Bioworlde公司）。PCR引物（大連寶生物工程有限公司合成），引物序列見表1。

1.4? 主要儀器

T100 RT-qPCR儀、Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀、半干轉膜儀、多功能熒光酶標儀均購于美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1? 藥物制備

澤瀉湯加味方：澤瀉21 g，白術9 g，澤蘭15 g，石菖蒲15 g按比例配備，加8倍體積超純水浸泡4 h，煎煮1 h，過濾取濾液，藥渣中再加6倍體積超純水，煎煮1 h，過濾取濾液，將2次濾液合并，濃縮制成60 g/L水煎劑，保存于-20 ℃冰箱中備用。

2.2? 鹽敏感性高血壓細胞模型建立

復蘇HBZY21細胞，用加有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM-H培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱培養。待細胞長至培養皿80%開始傳代，取第5～9代細胞對數生長期的細胞接種于6孔板內培養，采用NaCl 137 mmol/L和AngII10-6 mmol/L刺激HBZY21細胞24 h，設模型組、纈沙坦（1 μmol/L）組、澤瀉湯加味方高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組，分別干預處理24 h，另設正常腎小球細胞作為對照。收集細胞，分別提取總RNA及蛋白質，以備后續實驗。

2.3? 細胞活力檢測

采用CCK-8法，取對數增長期的細胞，按1×105個/mL密度接種于96孔板內，每組設5個復孔，加入含NaCl 137 mmol/L和AngII 10-6 mmol/L培養基內培養24 h，分為空白（無細胞）對照組，模型組，不同濃度的澤瀉湯加味方組：0.2、0.5、1、2、3、5 mg/L，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，每孔加入10 μL的5 g/L的CKK-8液，置于培養箱內孵育1～2 h，于酶標儀460 nm波長處測定各孔OD值。

細胞活力=（澤瀉湯加味方組OD值-空白對照組OD值）/（模型組OD值-空白對照組OD值）×100%。

2.4? RT-qPCR法檢測mRNA的表達

根據細胞活力實驗設定澤瀉湯加味方高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組，另設模型組、纈沙坦（1 μmol/L）組，各組均采用NaCl 137 mmol/L和AngII 10-6 mol/L刺激HBZY21細胞24 h，再分別給藥處理24 h。收集正常組和各處理組細胞，分別提取總RNA及蛋白質，以備后續實驗。Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計進行定量，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，SuperReal PreMix SYBR Green熒光定量檢測試劑盒分別檢測Agtr1a、Cyba、NOX4、β-actin mRNA的ct值，擴增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40個循環;做溶解曲線。以各目的基因ct值與β-actin mRNA的ct值的差值為△ct，采用2-△△ct法計算各基因mRNA的相對表達水平。

2.5? Western blot法檢測蛋白質的表達

RIPA裂解液處理提取各組細胞的總蛋白，Bradford蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。45 μg蛋白于SDS-PAGE 12%分離膠分離并轉膜，常溫封閉1 h， AT1R（1∶800）、P47（1∶100）、P22（1∶500）、P47（1∶100）、NOX4（1∶2 000）、β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入HRP標記山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗（1∶5 000），常溫孵育l h，洗膜后用超敏ECL化學發光試劑盒顯影。各蛋白目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為各蛋白質的相對表達水平。

2.6? 活性氧檢測試劑盒檢測ROS的表達水平

取對數增長期的細胞，按1×105個/mL密度接種于96孔板內，每組設5個復孔，加入含NaCl 137 mmol/L和AngII 10-6 mmol/L培養基內培養24 h，設模型組、纈沙坦（1 μmol/L）組、澤瀉湯加味方中藥高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組，分別干預處理24 h，另設分為空白（無細胞）對照組，正常腎小球細胞作為對照。去除培養液，每孔加入熒光探針DCFH-DA10 μmol/L，37 ℃孵育20 min，用無血清的無酚紅培養基洗滌細胞3次，加入無酚紅培養基后于熒光酶標儀下檢測各孔OD值，激發波長488 nm，發射波長525 nm。以正常組OD值與空白對照組OD值之間的差值的平均值并歸一后作為正常組ROS表達水平，其他各組

ROS相對表達水平=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（正常組OD值-空白對照組OD值）。

2.7? 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，數據以“x±s”表示，各組間數據兩兩比較采用單因素方差分析檢驗。

3 結果

3.1? 澤瀉湯加味方對鹽敏感性高血壓細胞活力的影響

與模型組相比，0.2 mg/L澤瀉湯加味方顯著提高了細胞活力（P<0.05）;而0.5、1、2 mg/L澤瀉湯加味方不同程度地降低了細胞存活率（P<0.05），1 mg/L澤瀉湯加味方抑制細胞增殖作用最明顯;此外，3、5 mg/L澤瀉湯加味方對細胞存活率無顯著影響。見表2。

3.2? 澤瀉湯加味方對各組細胞Agtr1a、Cyba、NOX4

mRNA表達的影響

RT-qPCR結果顯示，與正常組比較，模型組、澤瀉湯加味方高劑量組細胞中Agtr1a的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），模型組細胞中Cyba的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），模型組、澤瀉湯加味方低劑量組細胞中NOX4的mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及澤瀉湯加味方高、中、低劑量組Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達水平顯著降低（P<0.05）。各劑量澤瀉湯加味方組中，澤瀉湯加味方中劑量組Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA表達水平最接近正常組水平，組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

3.3? 澤瀉湯加味方對各組細胞AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與正常組比較，模型組細胞中AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），澤瀉湯加味方高、低劑量組細胞中AT1R、P47、NOX4蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），澤瀉湯加味方低劑量組細胞中P22蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及澤瀉湯加味方中劑量組AT1R、P22、P47、NOX4蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），澤瀉湯加味方高劑量組細胞中AT1R、P22、NOX4蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），澤瀉湯加味方低劑量組細胞中AT1R蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。各劑量澤瀉湯加味方組間，澤瀉湯加味方中劑量組對AngII-NADPH-ROS信號通路相關蛋白的下調作用最為明顯。見圖2。

3.4? 澤瀉湯加味方對各組細胞中ROS表達的影響

ROS檢測結果顯示，與正常組比較，模型組、澤瀉湯加味方高劑量組、低劑量組細胞中ROS的相對表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及各澤瀉湯加味方給藥組細胞中ROS的相對表達水平顯著降低（P<0.05），其中澤瀉湯加味方中劑量組ROS的相對表達水平接近正常組水平，組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

4 討論

中國60%的高血壓患者屬于“鹽敏感性高血壓”，即機體攝入高鹽大大超過腎臟的排鹽能力范圍繼而血壓隨之升高，是造成我國鹽敏感性高血壓發病率明顯增高的重要原因[1]，韓運峰等[10]發現在感覺神經損傷性鹽敏感性高血壓大鼠中，RAAS不完全受抑制，提示該模型的形成與RAAS中AngII-NADPH-ROS信號通路異常激活有關。

血管緊張素II（angiotensionII，AngII）是RAAS中最重要的效應因子。正常情況下，AngII通過與其受體AT1R結合，使交感神經末梢釋放遞質增多來維持體液穩態，起到正常調節血壓作用。然而在各種致病因素的損害下，使這種體液穩態被破壞，則可導致鹽敏感性高血壓的發生[11-12]。故本研究采用高鹽和AngII作為致病因素來破壞HBZY21大鼠腎小球系膜細胞的體外生存穩態，在體外水平模擬鹽敏感性高血壓模型。實驗結果發現，模型組細胞中Agtr1a的mRNA以及其翻譯的AT1R蛋白表達水平較正常組顯著升高，表明高鹽和AngII的共同刺激可促進AT1R的表達，AngII進入細胞與其受體AT1R的結合在細胞中發揮關鍵作用。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase， NADPH）氧化酶是一個由NADPH氧化酶NOX4、催化亞基p22和調節亞基p47等組成的多亞基復合體，在細胞內，AngII可與AT1R結合促進NADPH釋放電子到細胞膜外與氧分子結合生成活性氧物質（reactive oxygen species， ROS）[13]。在病理狀態下，ROS的過表達可引起鹽敏感性高血壓患者氧化應激反應增強，促進腎小球系膜細胞的增殖，腎小管血管內皮功能障礙或損傷，血管壁中膜肥厚，纖維化及炎癥反應，加劇腎損害[14-15]。本實驗結果發現，鹽敏感性高血壓細胞內NOX4的mRNA表達水平以及P47、NOX4蛋白表達水平顯著升高，說明AngII-NADPH-ROS信號通路的活化在鹽敏感性高血壓細胞中發揮關鍵作用。

纈沙坦可阻斷AngII與其受體AT1R結合，抑制AngII-NADPH-ROS信號通路的活化[16]，最終達到治療鹽敏感性高血壓的目的。本實驗結果也證明纈沙坦可顯著抑制鹽敏感性高血壓細胞中AngII-NADPH-ROS信號通路的活性。但長期服用纈沙坦等藥物，患者會出現頭痛、頭暈、病毒感染、上呼吸道感染、咳嗽、腹瀉、疲勞、鼻炎、背痛、惡心、咽炎及關節痛等副作用，對患者機體造成新的損害[17]。中藥則具有藥性溫和、不良反應少等特點。本研究采用的中藥澤瀉湯加味方在臨床治療鹽敏感性高血壓效果明顯[7]，然而其具體治療作用的分子機制研究較少。

澤瀉湯加味方是在漢·張仲景《金匱要略》澤瀉湯（澤瀉、白術）的基礎上，結合高血壓病程中普遍存在的水濁內結、痰濕阻滯、瘀血阻絡的研究成果，加用活血、祛痰、開竅的澤蘭、石菖蒲組成。有研究表明，澤瀉湯加味方可下調高鹽高血壓腎損害大鼠腎皮質中AT1R、AT2R的mRNA表達水平[18]。本研究中發現，采用0.5、1、2 mg/L的澤瀉湯加味方可顯著抑制鹽敏感性高血壓細胞的活性力。同時，進一步的分子機制研究發現，澤瀉湯加味方中劑量組（1 mg/L）較模型組細胞中Agtr1a、Cyba、NOX4的mRNA及AT1R、P21、P47、NOX4的蛋白表達水平顯著降低，其細胞內的ROS的活性顯著降低。由此表明澤瀉湯加味方中劑量組對AngII-NADPH-ROS信號通路的下調作用最為明顯。

綜上所述，澤瀉湯加味方可下調鹽敏感性高血壓細胞中AngII-NADPH-ROS信號通路的活化水平。我們推斷其作用機制，可能是通過占據纈沙坦AT1R結合部位，阻斷AngII與其受體結合，抑制AngII-NADPH-ROS信號通路有關的信號轉導分子表達，進而起到治療高血壓的作用。而其具體作用機制有待于進一步證實。

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