地瓜藤的UPLC指紋圖譜建立及聚類分析、主成分分析

徐鋒 楊瀾 成婷婷 黃旭龍 范東生 吳紅梅 王祥培

摘 要 目的：建立地瓜藤的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜。方法：采用UPLC法。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEF C18，流動相為0.2%乙酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），檢測波長為254 nm，流速為0.1 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為2 μL。以14號峰為參照，繪制10批地瓜藤藥材樣品及2批混淆品的UPLC指紋圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行相似度評價，確定共有峰;采用SPSS 20.0 軟件進行聚類分析，運用SIMCA 13.1軟件進行主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析。結(jié)果：10批地瓜藤藥材樣品共有28個共有峰，相似度在0.839～0.935之間，2批混淆品的相似度分別為0.503、0.173，表明本方法可區(qū)別地瓜藤與混淆品。聚類分析和主成分分析結(jié)果均顯示，10批地瓜藤藥材樣品可聚為2類，S3～S5、S9、S10聚為一類，其余聚為一類。正交偏最小二乘法判別分析結(jié)果顯示，共篩選出變量投影值>1的7個成分，這7個成分可能是引起10批地瓜藤藥材樣品質(zhì)量差異的主要成分。結(jié)論：所建指紋圖譜及聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析可用于地瓜藤藥材的鑒別和質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 地瓜藤;指紋圖譜;超高效液相色譜法;聚類分析;主成分分析;正交偏最小二乘法判別分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a UPLC fingerprint of Ficus tikoua. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC BEF C18 column with mobile phase consisted of 0.2% aqueous acetic acid-acetonitrile （gradient elution）; the detection wavelength was 254 nm; the flow rate was 0.1 mL/min; the column temperature was 25 ℃， and sample size was 2 μL. UPLC fingerprints of 10 batches of samples and 2 batches of adulterants were determined by using No. 14 peak as reference. The similarity evaluation was carried out by using the TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System （2012 edition） so as to determine common peak. The cluster analysis was performed by using SPSS 20.0 software. SIMCA 13.1 software was used to conduct the principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）. RESULTS： There were 28 common peaks in UPLC fingerprint of 10 batches of F. tikoua. The similarity of 10 batches of F. tikoua was between 0.839 and 0.935， and the similarities of the 2 batches of adulterants were 0.503 and 0.173 respectively， which indicated that F. tikoua could be distinguished from adulterants. 10 batches of F. tikoua could be divided into 2 categories by cluster analysis and principle component analysis， and S3-S5， S9 and S10 were grouped into one category， and the remaining batches were grouped into one category. 7 components with a variable importance in projection （VIP） value >1 were screened by OPLS-DA analysis. These 7 components may be the main components that caused the quality difference of 10 batches of F. tikoua samples. CONCLUSIONS： Established fingerprint， cluster analysis， principle component analysis and OPLS-DA can be used for the identification and quality control of F. tikoua.

KEYWORDS? ?Ficus tikoua; Fingerprint; UPLC; Cluster analysis; Principle component analysis; OPLS-DA

地瓜藤（Ficus tikoua Bur.）又稱地果藤、地板藤，為桑科植物地瓜藤的新鮮或干燥地上部分，具有清熱利濕、活血通絡、解毒消腫的功效，臨床上主要用于治療風濕疼痛、跌撲損傷等[1]。地瓜藤主要含有黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類、有機酸類等成分[2-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，地瓜藤具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒和抑菌等活性，具有較高的藥用價值[6-10]。湖南、云南、四川和貴州等省的藥材標準均收載了地瓜藤，主要記載了地瓜藤的來源、名稱、性狀、顯微鑒別、理化鑒別和薄層鑒別等項目[1，11-12]。但由于其產(chǎn)地和用藥習慣的差異，故存在同藥異名和異藥同名的現(xiàn)象，因此如何對地瓜藤進行準確、全面和快速的品種鑒別及質(zhì)量評價是值得探討的問題。

中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥經(jīng)適當處理后，能夠標示出該中藥材或中成藥特征的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜，可用于鑒別藥材真?zhèn)危u價原料藥材、半成品和成品質(zhì)量的均一性與穩(wěn)定性[13]。超高效液相色譜法（UPLC）相對于高效液相色譜法（HPLC）具有更好的分離效果、峰容量和靈敏度[14]。目前尚未見地瓜藤指紋圖譜研究的報道，基于此，本研究建立了地瓜藤藥材的UPLC指紋圖譜，并進行聚類分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），以期為高效、準確地鑒別地瓜藤藥材及其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class型UPLC儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進樣系統(tǒng)、柱溫箱、二極管陣列檢測器（美國Waters公司）;KQ-100E型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;HH-4型四孔電熱恒溫水浴鍋（常州華普達教學儀器有限公司）;AL204-IC型電子分析天平（美國Mettler-Toledo公司）;QJ-02A型粉碎機（上海兆申科技有限公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純（美國Tedia公司），其他試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

地瓜藤（編號：S1～S10）、紅薯藤（混淆品1，編號：S11）、沙葛藤（混淆品2，編號：S12）藥材均經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學藥學院王祥培教授鑒定分別為桑科植物地瓜藤（F. tikoua Bur.）的干燥莖葉、旋花科植物番薯[Ipomoea batatas（L.）Lam.]的干燥莖葉和豆科植物沙葛[Pachyrhizus erosus（Linn.）Urb.]的干燥莖葉。藥材樣品均密封保存于陰涼干燥處，其來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEF C18（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）;流動相：0.2%乙酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，95%A→90%A;3～5 min，90%A→85%A;5～10 min，85%A→76%A;10～21 min，76%A→58%A;21～24 min，58%A→40%A;24～28 min，40%A→0%A;28～29 min，0%A）;流速：0.1 mL/min;柱溫：25 ℃;檢測波長：254 nm;進樣量：2 μL。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取地瓜藤藥材樣品粉末3.0 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）提取30 min，濾過，濾液置于蒸發(fā)皿中;藥渣加甲醇30 mL，超聲提取30 min，濾過，重復提取3次，合并濾液。將盛有濾液的蒸發(fā)皿置于60 ℃水浴鍋揮干，揮干后所得固體加甲醇溶解并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。以14號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，28個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、9、12、16、21 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以14號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，28個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置21 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取地瓜藤藥材樣品（編號：S1）適量，共6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以14號峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，28個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜的建立與相似度、共有峰相關(guān)分析

2.4.1 UPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品（編號：S1～S10），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行分析，得UPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批藥材樣品（編號：S1～S10）進行相似度分析。結(jié)果表明，10批藥材樣品相似度在0.839～0.935之間，表明各批藥材間主要化學成分較為一致，結(jié)果見表2。

2.4.3 共有峰的確定及相關(guān)分析 10批藥材樣品（編號：S1～S10）共有28個共有峰，其峰面積占色譜峰總面積的90%以上，提示該方法可用于評價藥材的整體質(zhì)量。以峰面積較大和分離度較好的14號峰為參照峰，計算其他峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表3、表4。

2.4.4 地瓜藤藥材與混淆品的UPLC圖譜比較 將10批藥材樣品（編號：S1～S10）與2批混淆品（編號：S11～S12）的色譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），生成12批樣品的UPLC指紋圖譜，詳見圖2。軟件分析結(jié)果顯示，紅薯藤（編號：S11）相似度為0.503，沙葛藤（編號：S12）相似度為0.173，表明建立的指紋圖譜可用于鑒別地瓜藤藥材與其混淆品。

2.5 聚類分析

以14號峰為參照，以10批藥材樣品（編號：S1～S10）中28個共有峰的相對峰面積為變量，標準化組成10×28階原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 20.0 軟件進行聚類分析，采用組間連接法，以歐式距離作為樣品的測度[15]。結(jié)果，10批藥材樣品可聚為2類，S3～S5、S9、S10聚為一類，S1、S2、S6～S8聚為一類，詳見圖3。

2.6 PCA分析

以14號峰為參照，以10批藥材樣品（編號：S1～S10）中28個共有峰的相對峰面積為變量，導入 SIMCA 13.1軟件，采用非監(jiān)督模式識別法進行PCA分析，模型自動擬合選擇4個主成分，其累積方差貢獻率為 79.87%，提示模型預測良好，詳見圖4。由圖4可知，10批藥材樣品可分為2組，S3～S5、S9、S10為一組，S1、S2、S6～S8為一組，該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

2.7 OPLS-DA分析

為更好地觀察組間差異，基于主成分分析結(jié)果，采用監(jiān)督模式識別法進行兩組間OPLS-DA分析，繪制OPLS-DA模型得分圖，詳見圖5。由圖5可知，不同產(chǎn)地的地瓜藤藥材樣品集中在不同區(qū)域，S1、S2、S6～S8在模型得分圖的左側(cè)，其余樣品（S3～S5、S9、S10）在右側(cè)，與PCA分析結(jié)果一致。OPLS-DA模型中的擬合參數(shù)R2X=0.795，R2Y=0.991，模型預測參數(shù)（Q2）=0.823，均大于0.5，表明所建模型穩(wěn)定且預測能力較強。以模型變量投影（VIP）值為指標對引起組間差異的成分進行分析，篩選貢獻較大的7個變量（以VIP值>1為標準[16]），分別為15號峰（VIP=2.304 5）、1號峰（VIP=1.942 8）、12號峰（VIP=1.901 7）、18號峰（VIP=1.719 1）、27號峰（VIP=1.371 9）、10號峰（VIP=1.357 1）和9號峰（VIP=1.088 9），提示上述7個成分是引起10批地瓜藤藥材樣品質(zhì)量差異的主要成分，詳見圖6。

3 討論

本研究前期預試驗中比較了水-甲醇、水-乙腈、0.2%乙酸水溶液-甲醇、0.1%乙酸水溶液-乙腈、0.2%乙酸水溶液-乙腈等不同流動相系統(tǒng)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.2%乙酸水溶液-乙腈為流動相進行梯度洗脫時，各峰分離度較好，且保留時間較短。通過全波長掃描和多通道波長檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測波長為254 nm時色譜峰較多，基線平穩(wěn)，特征峰信號較明顯，故選擇254 nm為檢測波長。此外，又考察了不同流速（0.1、0.2 mL/min）對色譜峰分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速為0.1 mL/min時，各成分分離度較好，對色譜柱柱壓適中。

相似度評價結(jié)果顯示，10批地瓜藤藥材樣品的相似度為0.839～0.935，共有28個共有峰，但各峰的相對峰面積差異較大，這可能與不同生長環(huán)境下地瓜藤藥材的化學成分積累的差異有關(guān)，提示地瓜藤藥材的生長環(huán)境可能會影響其質(zhì)量和臨床效果。此外，2批混淆品的相似度均小于0.6，表明本文建立的指紋圖譜專屬性較強，可用于地瓜藤藥材的鑒別，也可為控制和評價地瓜藤藥材的整體質(zhì)量提供參考。

聚類分析和PCA分析結(jié)果均顯示，10批地瓜藤藥材樣品分為2類，S3～S5、S9、S10為一類，S1、S2、S6～S8為一類。OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，有7個成分的VIP值均大于1，提示地瓜藤藥材中這7個成分受生長環(huán)境的影響較大，以致質(zhì)量存在差異，這可能與地瓜藤藥材的產(chǎn)地、采收時間和貯藏條件等因素有關(guān)。

綜上所述，所建指紋圖譜以及聚類分析、PCA分析、OPLS-DA分析可用于地瓜藤藥材的鑒別和質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2019-06-29 修回日期：2019-11-06）

（編輯：陳 宏）