通便湯對慢傳輸型便秘大鼠結腸c- kit和MLCK表達的影響

樂音子，王曉鵬，甄曙光，孫明明，吳本升，顏 帥，3

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)是指結腸傳輸功能障礙所致結腸通過時間延長導致的便秘[1]，該病是全球發病率較高的功能性結腸紊亂疾病，影響14%成人和36%的老年人[2]。便秘本身的危害性有一定局限性，但它能增加腎臟疾病、帕金森病和結腸癌等許多相關疾病的風險[3-4]。文獻研究[5]表明超過30%的STC患者對目前許多防治便秘藥物或保守的治療方案無效。

通便湯是課題組通過對吳門醫派明清時期吳門醫家辨治便秘的醫案進行數據挖掘后結合目前慢性便秘的病因形成的重組方[6-7]，前期臨床研究證明通便湯可顯著提升短鏈脂肪酸的含量，改善功能性便秘患者單次排便時間和間隔時間積分以及便秘患者生存質量量表評分[8]，尤其對瀉藥依賴性老年便秘患者臨床療效確切[9]。該研究采用鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃法復制STC大鼠模型，以結腸c- kit和MLCK蛋白變化情況為著眼點，部分闡明通便湯治療STC作用機制，為通便湯治療STC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級雄性健康Sprague Dawley大鼠60只，體質量(155±10)g，實驗動物合格證號：SCXK-(滬)2013-0006，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供。飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心，許可證號：SYXK(蘇)2014-0001。飼養條件為濕度(50±6)%，人工光照明暗各12 h，溫度20～26 ℃。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器鹽酸洛哌丁胺膠囊(西安楊森制藥有限公司)；枸櫞酸莫沙必利膠囊(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；活性炭、水合氯醛(上海國藥集團化學試劑有限公司)；c- kit兔抗鼠多克隆抗體、兔抗MLCK單克隆抗體(美國Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(上海賽默飛世爾科技公司)；DAB顯色試劑盒等(蘇州科貝生物技術有限公司)。

通便湯湯劑由肉蓯蓉30 g，生白術30 g，檳榔15 g，瓜蔞皮15 g，紫苑12 g，杏仁12 g，枳實15 g，全當歸15 g，生黃芪30 g，陳皮10 g，桔梗10 g，鎖陽15 g。上述十二味藥材均購自安徽省豐原銅陵中藥飲片有限公司。通便湯水煎取濃縮汁，貯存于4 ℃冰箱中備用。FA100上皿電子天平(上海精科天平儀器廠)；866A 恒溫鼓風干燥箱(上海浦東榮豐儀器公司)；CX22生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；RM2235組織切片機(德國徠卡公司)；Tissue-Tek TEL組織包埋機(日本SAKURA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1分組與造模 將60只雄性健康SD大鼠，隨機分為正常組(10只)和建模組(50只)。正常組大鼠喂養普通干飼料，不限飲水。慢傳輸型便秘大鼠模型的建立：建模組50只大鼠，參照Jabri et al[10]用洛哌丁胺混懸液灌胃(西安楊森制藥有限公司；國藥準字H20051719，5 mg×24片)，給藥劑量為3 mg/(kg·d)，每日給藥2次，分別是9 ∶00和17 ∶00；連續14 d后，通過活性炭灌胃法，STC模型成功的標志：模型組大鼠糞便含水量和排便量明顯少于造模前，確定STC大鼠模型復制成功后，隨機分為模型組、通便湯低、中、高劑量組和莫沙必利組各10只。其中正常組和模型組均給予等體積的蒸餾水灌胃，通便湯給藥劑量分別按照體表面積換算系數折算，通便湯低、中、高劑量組分別按照9.4、18.8、37.6 mg/kg分別灌胃，莫沙必利組懸濁液按照1.58 mg/kg灌胃，2次/d，連續14 d 。

1.3.2標本采集與處理 采集標本前，在末次給藥禁食不禁水12 h，麻醉前1 h稱重，水合氯醛麻醉開腹，10%活性炭混懸液2 ml灌胃，30 min后處死大鼠。取出大鼠全部腸段，計算活性炭混懸液小腸推進率。大鼠橫結腸處取兩份新鮮腸段組織，分別置入多聚甲醛固定液和-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3.3糞便含水率情況 將各個時間段的大鼠糞便放入烤箱，150 ℃烘烤10 min。糞便含水率=(濕糞質量-干糞質量)/濕糞質量×100%。

1.3.4HE染色 HE染色后觀察結腸肌層厚度和腸絨毛的高度。

1.3.5一氧化氮(NO)、一氧化氮酶(nitric oxide synthase, NOS)含量檢測 采用ELISA法按照說明書操作檢測液氮罐中結腸組織中NO和NOS含量。

1.3.6免疫組化法測定大鼠結腸組織中c- kit、MLCK蛋白表達情況 取大鼠結腸石蠟切片，免疫組化染色，高倍顯微鏡(×200)下觀察結腸組織單位面積上c- kit、MLCK的陽性表達。

2 結果

2.1 通便湯對STC大鼠含水率的改善情況與正常組比較，模型組大鼠糞便含水率明顯下降(P<0.05)。與模型組比較，通便湯各劑量組糞便含水率均明顯升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠糞便含水率及腸道推進率比較

與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 通便湯對STC大鼠小腸推進率的改善情況由表1可知，與正常組比較，模型組大鼠腸道推進率下降明顯(P<0.05)。與模型組比較，通便湯各劑量組和莫沙必利組腸道推進率有所上升，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 各組結腸病理切片情況由圖1所示，正常組大鼠結腸黏膜完整，腸壁黏膜層、黏膜下層、肌層、外膜層四層組織結構清晰，柱狀細胞和腺體排列整齊，未見炎癥細胞聚集；模型組黏膜層間質血管擴張、充血；通便湯各劑量組與莫沙必利組腸黏膜腺體排列整齊，未觀察到明顯上皮損傷。從表2可以看出，與正常組相比，模型組大鼠結腸肌層厚度和腸絨毛的高度有顯著差異(P<0.05)；經過通便湯和莫沙必利治療后大鼠結腸肌層厚度和腸絨毛的高度均有所恢復，其中以通便湯高劑量組尤為明顯(P<0.05)。

表2 各組大鼠結腸肌層厚度和腸絨毛的高度比較

與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.4 通便湯對STC大鼠結腸組織中腸神經遞質NO和NOS的影響與正常組比較，模型組大鼠結腸組織中NO和NOS含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠結腸組織NO和NOS含量明顯降低(P<0.05)，其中通便湯低、中、高劑量組且呈劑量依賴性降低趨勢，見圖2、3。

圖1 各組大鼠結腸病理學變化 ×200

圖2 通便湯對STC大鼠結腸組織中NO的影響

與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 通便湯對STC大鼠結腸組織中c- kit和MLCK蛋白的影響由圖4所示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織中c- kit陽性細胞明顯減少，分布較稀疏；通便湯低、中、高劑量組以及莫沙必利組結腸組織中c- kit陽性細胞表達呈不同程度增加，分布密集。與正常組比較，模型組大鼠c- kit陽性染色平均光密度值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，通便湯低、中、高劑量組、莫沙必利組c- kit陽性染色平均光密度值顯著升高(P<0.05)；與莫沙必利組比較，通便湯中、高劑量組c- kit蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)；表明通便湯可增加Cajal間質細胞的數量及改善其分布，見表3。由圖5可知，各組大鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層和肌層中可見平滑肌細胞胞質內棕黃色顆粒，顏色深淺與稠密程度不一的棕黃色顆粒。與正常組比較，模型組大鼠結腸肌層平滑肌細胞胞質染色呈淺黃色，MLCK蛋白光密度值顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，通便湯各劑量組、莫沙必利組MLCK蛋白光密度值顯著升高(P<0.05)，見表3。

圖3 通便湯對STC大鼠結腸組織中NOS的影響

圖4 各組大鼠結腸組織c- kit蛋白表達 ×200

圖5 各組大鼠結腸組織MLCK蛋白表達 ×200

表3 各組大鼠結腸組織中c- kit和MLCK光密度比較

與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

STC發病機制復雜，治療方法繁多，但療效欠佳。Cajal間質細胞是胃腸起博細胞，是腸神經系統(enteric nervous system, ENS)控制胃腸平滑肌運動的中介，參與胃腸道神經遞質的信號傳導[11]。c- kit基因是Cajal細胞的特異性標志物，有研究[12]顯示，STC大鼠c- kit的表達在升結腸和降結腸均低于對照組，進一步證明結腸內Cajal細胞數目減少參與STC發病過程。結腸組織ICC數量減少及其結構破壞，導致平滑肌收縮運動失常從而出現結腸動力障礙[13]。除此之外，研究[14]表明平滑肌收縮對于胃腸動力的變化具有重要的調控作用，其收縮性下降會導致腸蠕動下降，進而誘發便秘發生。MLCK是平滑肌收縮的核心蛋白，當平滑肌細胞收到刺激，胞內鈣離子濃度陡然升高，并與CaM結合Ca2+形成復合物，使肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化，導致平滑肌細胞產生收縮[15]。再者，信使分子NO作為ENS中重要抑制性神經遞質，參與調節腸道動力；NO主要由NOS合成，NOS通過催化L-精氨酸生成NO，NOS活性變化影響NO的生成量；NO激活可溶性鳥苷酸環化酶，cGMP濃度升高，引起結腸蠕動減弱[16]。

前期研究[17]證實通便湯通過改善腸道菌群提高老年性慢傳輸型便秘患者臨床療效確切，此外，通便湯還能明顯降低STC大鼠結腸肌電時頻率和振幅變異系數，穩定結腸慢波節律。因此本研究擬從腸神經遞質、結腸Cajal細胞和平滑肌肌源性角度觀察通便湯對STC大鼠結腸Cajal細胞和平滑肌細胞MLCK蛋白的影響。結果顯示，與模型組大鼠比較，通便湯各劑量組可顯著提高STC大鼠糞便含水率及腸道推進率(P<0.05)，同時升高c- kit和MLCK蛋白表達量及降低結腸組織NO和NOS的水平(P<0.05)，從而防治STC。本研究還觀察到通便湯可增加STC大鼠結腸肌層厚度，恢復腸絨毛的高度；腸絨毛的高度與腸吸收面積成正比，通便湯改善腸道菌群與此是否有關值得進一步的實驗驗證。

本項研究仍有許多待完善之處：通便湯是臨床中藥復方制劑，因經費等客觀原因暫時未明確本方的有效物質基礎；且對STC大鼠結腸組織中Cajal細胞僅僅進行初步的觀察和探討。下一步課題組將采用液相色譜-質譜聯用技術明確通便湯有效成分；結合網絡藥理學分析技術對通便湯多成分、多靶點、多通路的相互作用規律和調控網絡進行挖掘和分析，以期為后續深入研究通便湯調控ICC網絡改善STC作用機制和發展新的有價值的藥物奠定基礎。