體外siRNA- Nav1.5干擾口腔鱗癌HSC- 3細胞生物學行為研究

戴永錚，錢成煒，徐小立，蔣 勇

口腔鱗狀細胞癌復發(fā)率高、生存周期短，手術治療的局限性造成治療效果差，因而新的治療方法對提高患者生存率具有重要意義。電壓門控鈉離子通道(voltage- gated sodium channel，VGSC)是一種跨膜糖蛋白，由一個α亞基和多個β亞基組成。根據(jù)α亞基的不同可將其分為9種，即Nav1.1- Nav1.9[1]。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)， Nav1.5在包括前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、宮頸癌[5]和非小細胞肺癌[6]等多種腫瘤中高表達，對腫瘤的增殖、侵襲等生物學過程具有明顯的調節(jié)作用。在口腔鱗癌中，研究[7]顯示Nav1.5在癌組織中的表達相比正常組織明顯升高，但其在口腔鱗癌中的表達調控機制研究甚少。該研究通過檢測Nav1.5的表達水平變化以及在增殖和侵襲中具有重要作用的相關蛋白檢測，來分析其對口腔鱗癌細胞增殖和侵襲的作用，為口腔鱗癌的靶向治療尋求新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；胰酶消化液、細胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、 RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Nav1.5多克隆抗體購自美國Abcam公司；基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP- 2)、 MMP- 9多克隆抗體購自美國santa cruz公司；山羊抗鼠、抗兔IG抗體購自北京中杉金橋公司；CCK8試劑盒購自日本同仁公司；PCR引物購自上海生物工程股份有限公司；逆轉錄試劑盒、 實時熒光定量PCR(Real Time- PCR，RT- PCR)試劑盒購自日本Takara公司； PVDF 膜購自美國Invitrogen公司；Matrigel膠、Transwell小室購自美國Corning公司；siRNA- Nav1.5購自上海吉瑪公司；lipo2000、CO2恒溫孵箱購自美國Thermo Fisher公司；RT- PCR儀購自美國Stratagene公司；酶標儀購自美國Bio- tek公司。收集安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科口腔鱗癌組織(2例)和正常口腔黏膜組織(牙齦2例)，標本取下直接保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1組織免疫組化 4%甲醛固定組織6 h，石蠟包埋，4 μm厚切片，60 ℃烤片4 h，脫蠟至水，抗原修復，3% H2O2室溫孵育10 min，1 ∶200稀釋Nav1.5一抗4 ℃孵育過夜(16 h左右)，HRP二抗37 ℃、 30 min，DAB顯色，蘇木精復染，封片，鏡下觀察。

1.2.2細胞培養(yǎng) HSC- 3細胞在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d傳代一次。

1.2.3免疫熒光實驗 將細胞以5×105個/ml的密度接種于共聚焦小皿，孵箱過夜。4%多聚甲醛室溫下固定30 min，0.5% Trixton X- 100室溫下穿通20 min，1% BSA封閉細胞30 min， 加入Nav1.5的一抗(6 μg/ ml)冰箱孵育24 h，次日室溫孵育1 h。 加入羅丹明標記的二抗(1 ∶50)避光孵育2 h，DAPI(1 ∶2 000)避光孵育8 min。在Zeiss LSM510共聚焦成像系統(tǒng)下觀察細胞。

1.2.4siRNA轉染實驗 美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information，NCBI)上查找Nav1.5的序列，根據(jù)目的基因序列設計合成3條Nav1.5的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)組，以及一條陰性對照(negative control，NC)組，同時設置空白對照(control，CON)組，序列見表1。轉染前1 d，將2×105個/ml細胞接種于培養(yǎng)板中，每孔中加入約500 μl無抗生素的培養(yǎng)基。取1 μl/孔lipo2000，用50 μl opti- MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，并室溫孵育5 min。取2 μl siRNA，以50 μl opti- MEM無血清培養(yǎng)基稀釋，混勻。2種液體輕輕混勻，室溫靜置20 min。加入含有細胞及培養(yǎng)液的孔中，混勻。轉染6 h后，換為含血清的完全培養(yǎng)基。見表1。

1.2.5RT- PCR檢測 按TRIzol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，使用PrimeScriptTM- PCR kit逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，然后以此為模板，用目標基因的引物進行擴增和檢測。反應條件：95 ℃、1 min，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s。每個樣品設置3個復孔，PCR的所有引物均由上海生物工程公司進行設計合成，序列見表2。

表2 引物序列

1.2.6Western blot 檢測 用RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白。BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，調整各組濃度一致后，99 ℃、10 min使蛋白變性，SDS- PAGE凝膠電泳，然后轉移至0.45 μm的PVDF膜上，5% BSA封閉，一抗、二抗孵育，經ECL曝光成像。

1.2.7Transwell實驗 Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基按1 ∶9混勻制成稀釋液。小室濾膜均勻涂抹50 μl稀釋液，37 ℃、5% CO2恒溫箱滯留2 h。取3組培養(yǎng)24 h細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液得下層細胞，DMEM重懸計數(shù)，細胞密度調為1×106個/ml。上室加細胞懸液各100 μl，下室加600 μl 20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2恒溫箱孵育24 h，每組細胞設3個復孔。取出小室，吸出上室培養(yǎng)液，擦凈上室表面Matrigel膠，4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色20 min，晾干，拍照，200倍顯微鏡下計算穿膜細胞數(shù)。

1.2.8CCK8檢測細胞增殖活性 待檢測細胞計數(shù)，并鋪于96孔板。確定細胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h使其貼壁緊密。96孔板每個孔加10 μl CCK8溶液，在培養(yǎng)箱孵育1 h，顯色反應后，酶標儀測定450 nm處吸光度值(optical density，OD)，每組設5個復孔。根據(jù)OD450值繪制12 、24 、48 、72 h柱狀圖。

2 結果

2.1 組織和細胞中Nav1.5的表達臨床收集的正常口腔黏膜組織和口腔鱗癌組織做免疫組化，光鏡下觀察組織中Nav1.5蛋白表達情況，癌組織中于細胞的胞膜和胞質中出現(xiàn)不同程度的棕黃深染，即Nav1.5蛋白呈陽性表達，在正常口腔黏膜組織中幾乎看不到棕黃色，見圖1。HSC- 3細胞中免疫熒光染色激光共聚焦鏡下觀察，在胞質和胞膜上可見熒光標記的Nav1.5呈紅色，胞核呈藍色，Nav1.5在HSC- 3細胞中陽性表達，見圖2。

圖1 免疫組化法檢測Nav1.5蛋白的表達 ×100A：正常組織染色陰性；B：癌組織染色陽性

圖2 免疫熒光法檢測HSC- 3細胞中Nav1.5的表達 ×200

A：細胞核的染色呈藍色；B：Nav1.5蛋白的染色呈紅色； C：A和B的合成圖

2.2 HSC- 3細胞Nav1.5的沉默效率FAM標記的siRNA轉染HSC- 3細胞，鏡下觀察細胞，與明場視野下對比，轉染效率較高。RT- PCR和Western blot 結果顯示與CON組比較，S1、S2和S3組Nav1.5的mRNA表達均有所下調，S2和S3組下調較多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。CON組和NC組之間差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。因此以下實驗均采用S3轉染。

2.3 Nav1.5對HSC- 3細胞增殖和侵襲的影響CCK8檢測干擾后的細胞在450 nm處OD值，測量結果顯示，在轉染48 h后siRNA組(1.31±0.21)與CON組(1.06±0.22)和NC組(0.67±0.09)比較差異有統(tǒng)計學意義(F=9.006，P<0.01)，CON組和NC組之間差異無統(tǒng)計學意義，見圖4。Transwell侵襲實驗結果表明，siRNA組(7.33±1.55)與CON組(55.0±3.00)和NC組(47.0±4.00)比較，穿過小室細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(F=222.7，P<0.001)，CON組和NC之間差異無統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖3 經siRNA轉染后Nav1.5沉默效率

A：轉染FAM標記siRNA明場視野下；B：同一視野下熒光觀察×200；C：轉染后各組Nav1.5 mRNA相對表達水平；與CON組比較：**P<0.01；D：轉然后各組Nav1.5蛋白表達水平；S1、S2和S3分別代表轉染不同序列siRNA- Nav1.5

圖4 經siRNA干擾后HSC- 3細胞OD450值比較

2.4 RT- PCR和Western blot檢測轉染siRNA- Nav1.5對相關蛋白表達的影響經siRNA- Nav1.5轉染后的HSC- 3細胞內PCNA、MMP- 2和MMP- 9基因水平表達和蛋白水平表達均有所下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=15.12、22.89、11.72，P<0.05)，見表3和圖6、7。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌作為頜面部最常見的惡性腫瘤，常常發(fā)生區(qū)域淋巴結轉移，晚期可發(fā)生遠處轉移，嚴重威脅著人類的健康。為了克服傳統(tǒng)手術加放化療治療方法的弊端，分子靶向治療越來越重要。為了尋找更為有效的治療靶點，在本課題組的早期研究中，劉偉佳 等[7]發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細胞癌中，Nav1.5的表達與正常組織相比顯著提高，本研究免疫組化結果也得到證實。此外，Nav1.5的表達與組織分化程度和淋巴結轉移有關，這提示著Nav1.5有望成為口腔鱗癌治療的新靶點。

圖5 經siRNA轉染后HSC- 3細胞侵襲性比較 ×200

A：CON組；B：NC組；C：siRNA組; 與CON組比較：***P<0.001；與NC組比較：###P<0.001

表3 轉染siRNA及空白組相關蛋白mRNA表達量

與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01

近年來，越來越多的研究[8-11]發(fā)現(xiàn)Nav1.5與癌癥密切相關，并表明Nav1.5在癌癥增殖轉移中發(fā)揮著重要作用。Mohammed et al[8]研究顯示Nav1.5在高侵襲性乳腺癌細胞的胞質和核周區(qū)域以及板狀偽足中表達。本研究免疫熒光共焦顯微鏡的結果顯示HSC- 3細胞中也有著相同分布。為探討Nav1.5對HSC- 3細胞增殖和侵襲能力的影響，本研究對HSC- 3細胞進行siRNA- Nav1.5干擾實驗，RT- PCR和Western blot檢測干擾后HSC- 3細胞中Nav1.5出現(xiàn)明顯下調后再分別進行Transwell侵襲實驗和CCK8檢測干擾后細胞增殖OD值，實驗結果顯示經siRNA- Nav1.5干擾后的HSC- 3細胞的增殖和侵襲能力顯著下降。說明Nav1.5在口腔鱗癌細胞生物學特性方面具有重要的調節(jié)作用。在乳腺癌的研究[9]中也有著相似的結果，沉默Nav1.5基因后，MDA- MB- 231細胞的侵襲能力顯著降低。在結腸癌中，研究[10]表明Nav1.5基因涉及廣泛的信號調節(jié)并參與腫瘤細胞侵襲的調節(jié)，是癌細胞侵襲的關鍵驅動因子。在動物體內研究[11]中，發(fā)現(xiàn)敲低Nav1.5顯著抑制了腫瘤的生長和體內局部侵襲。盡管證明了Nav1.5在口腔鱗狀細胞癌的生長和轉移中起重要作用，但其具體機制尚不清楚。

PCNA與細胞的DNA合成密切相關，在細胞的增殖中起關鍵作用，也是細胞異常增殖的關鍵蛋白，有研究[12]表明，相比正常口腔組織在口腔鱗狀細胞癌中PCNA過表達，提示其與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程有關。在本實驗中，RT- PCR和Western blot結果顯示經siRNA- Nav1.5轉染的HSC- 3細胞內PCNA表達下降。對腫瘤侵襲和轉移機制的研究發(fā)現(xiàn)：細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的降解是腫瘤侵蝕正常組織并引發(fā)轉移的重要途徑。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase ，MMPs)是最重要的，可以降解ECM的所有成分，近年來已成為腫瘤侵襲和轉移研究的熱點，其中又以MMP- 2和MMP- 9最為重要。Chandolia et al[13]研究發(fā)現(xiàn)：相比正常口腔黏膜上皮，口腔鱗癌中MMP- 9表達水平顯著提高。在本實驗中，轉染siRNA- Nav1.5 48 h后HSC- 3細胞內MMP- 2和MMP- 9表達均下調。以上結果說明口腔鱗癌中Nav1.5可能通過直接或間接地調控PCNA、MMP- 2和MMP- 9的表達進而影響著細胞生物學行為的改變。

圖6 RT- PCR檢測MMP- 2、MMP- 9和PCNA mRNA表達

A：MMP- 2 mRNA相對表達量； B：MMP- 9 mRNA相對表達量； C：PCNA mRNA相對表達量；與CON組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001； 與NC組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖7 Western blot檢測干擾后HSC- 3細胞PCNA、MMP- 2和MMP- 9蛋白的表達變化

與CON組比較：*P<0.05； 與NC組比較：#P<0.05

為了進一步研究證明動物體內Nav1.5的生物學作用，下一步將進行裸鼠皮下造瘤后的進一步動物實驗，從而推進Nav1.5作為臨床口腔鱗癌治療靶點的應用。