N- 硬脂酰絲氨酸對APP/PS1轉基因小鼠學習記憶及運動能力的影響

劉 沙，周 毅，鄭琪雪，張王剛，李淋淋，姜 浩，尤思路

花生四烯酸乙醇胺(anandamide，AEA)通過激動大麻素I型(cannabinoid receptor 1, CB1)和II型(cannabinoid receptor 2, CB2)受體起到較好的神經保護活性[1]。但由于AEA消除較快，不能維持其較好作用[2]。因此，基于AEA化學結構式，合成了其類似物脂肪酰氨基酸- N- 硬脂酰絲氨酸(N- stearoyl serine，NSS)。研究[3]表明，脂肪酰氨基酸能改善細胞損傷。提示NSS是潛在的神經保護候選藥物，但是其在阿爾茨海默病中的活性不詳。同時脂肪酰氨基酸作為AEA類似物具有和AEA相似的生物活性。提示NSS對腦損傷的保護作用可能通過大麻素受體介導。該研究基于APP/PS1轉基因小鼠探討NSS對APP/PS1轉基因小鼠行為學異常及神經保護活性的研究，為進一步深入研究大麻素受體的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 健康雄性C57BL正常小鼠10只，轉基因小鼠120只，體質量(30±1)g，清潔級，成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK(川)2015-196。APPswe/PS1dE9雙轉基因雄性小鼠，體質量(30±1)g，清潔級，南京君科生物科技有限公司提供，許可證號：SYXK(川)2015-196。

1.1.2 試劑NSS由實驗室自主合成，純度經HPLC分析為≥98%，于冰箱保存NSS母液(20 mg/ml)；Western blot所用試劑及抗體(美國cell signaling technology公司)；辣根過氧化酶標記抗鼠IgG(美國proteintech公司)；Aβ42和Aβ40ELISA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；AM251(美國Selleck生物科技有限公司)；AM630(上海sigma公司)；石杉堿甲(四川辰馬生物科技有限公司)。

1.1.3儀器 多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ChemiDoc XRS系統(美國MD公司)；轉棒式疲勞儀、Morris水迷宮視頻分析系統(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及給藥 所有動物飼養于動物房，每天光照時間12 h，溫度(25±2)℃，自由進水進食。每天灌胃給藥1次，連續給藥2個月。實驗共分為14組，每組8只：① control組：C57BL/6J野生型小鼠；② model組：APP/PS1轉基因小鼠；③ 1、2、5 mg/kg NSS組：分別利用1、2、5 mg/kg NSS處理APP/PS1轉基因小鼠，共3組；④ 1、2、5 mg/kg NSS + AM251組：分別利用1、2、5 mg/kg NSS和2 mg/kg AM251共同處理APP/PS1轉基因小鼠，共3組；⑤ 1、2、5 mg/kg NSS+AM630組：分別利用1、2、5 mg/kg NSS和2 mg/kg AM630共同處理APP/PS1轉基因小鼠，共3組；⑥ AM251組：利用2 mg/kg AM251處理APP/PS1轉基因小鼠；⑦ AM630組：利用2 mg/kg AM630處理APP/PS1轉基因小鼠；⑧ Y組：陽性對照組：利用5 mg/kg石杉堿甲處理APP/PS1轉基因小鼠。

1.2.2開場實驗[4]將小鼠放于開場箱的中間使其自由活動5 min，自動攝像儀將記錄小鼠行跡的過程及在箱體中的運動總路程，以及小鼠在箱體角落，邊緣及中央區域的運動時間。

1.2.3疲勞轉棒儀實驗[5]使用疲勞轉棒儀每天對小鼠進行轉棒訓練3次，使小鼠在5 min內基本能夠隨轉棒而做相應的運動，避免在轉棒上失去平衡而掉落。以30 r/min的速度迫使小鼠在棒上運動。記錄各組小鼠在轉棒上的停留時間。

1.2.4水迷宮實驗(morris water maze，MWM)[6]將水迷宮分為4個象限，一個有機玻璃平臺(10 cm×30 cm)放置于其中一個象限，隱沒于水面下1～2 cm。將小鼠從任意一個象限放入水中，自動攝像儀將從小鼠入水時跟蹤小鼠的行跡，記錄小鼠行跡的過程及尋找水下平臺的時間。水迷宮實驗主要包括定位航行實驗和空間探索實驗。① 定位航行實驗主要訓練小鼠和測試小鼠學習記憶能力。實驗前1 d，將每只小鼠分別放入水中自由活動60 s，以適應環境。實驗第1～14天，小鼠分別從4個入水點面向池壁放入水中若干次，利用水迷宮分析系統記錄其尋找到隱沒于水下平臺的時間。若小鼠在60 s內未找到平臺，將其引導至平臺上停留20 s。通過計算各組小鼠每天到達平臺的平均時間，評估小鼠的空間學習記憶能力。② 空間探索實驗檢測小鼠訓練后對平臺空間位置的記憶能力。此實驗基于定位航行實驗后去除平臺的水迷宮實驗裝置，在定位航行實驗第15天任選1個入水點將小鼠放入水池中，記錄其在60 s內的游泳軌跡，軟件自動分析其在各象限所用的時間，考察小鼠記憶隱沒于水面下平臺的能力。

1.2.5ELISA實驗檢測Aβ42及Aβ40的含量 用生理鹽水灌流清除血液后獲取小鼠腦組織樣品，剝離出海馬組織，加入中等強度的RIPA蛋白裂解液，4 ℃冰浴勻漿產物，12 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測樣品，用于Aβ42及Aβ40檢測，操作步驟參照Invitrogen試劑盒說明書。

1.2.6Western blot實驗檢測CB2的蛋白表達水平 收集各組海馬區域，RIPA裂解液于冰上裂解，離心后收集上清液即總蛋白，并加入5×SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸8 min；通過SDS- PAGE分離并轉移至PVDF膜上，加入一抗兔抗鼠CB2(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶4 000)，4 ℃過夜孵育；將膜洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG(1 ∶8 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后化學發光顯色，照相。應用Tanon Gel pro凝膠成像系統軟件測定條帶灰度值。以GAPDH作為參照，計算目標蛋白相對含量，不同組別進行比較。

2 結果

2.1 NSS對APP/PS1轉基因小鼠自主活動能力的影響model組小鼠相對于control組小鼠在開場實驗中的運動總路程明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1；與model組比較，NSS組小鼠的運動總路程無顯著性差異。同時，小鼠在開場中央、邊緣及角落等區域均無統計學意義。

圖1 NSS對APP/PS1轉基因小鼠自主活動能力的影響

1:Control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；6：NSS 1 mg/kg+AM251組；7：NSS 2 mg/kg+AM251組；8：NSS 5 mg/kg+AM251組；9：NSS 1 mg/kg+AM630組；10：NSS 2 mg/kg+AM630組；11：NSS 5 mg/kg+AM630組；12：AM251組；13：AM630組；14：Y組；與model組比較：*P<0.05

2.2 NSS對APP/PS1轉基因小鼠運動能力的影響隨著訓練時間延長，小鼠停留于轉棒時間明顯延長。訓練到第6天時，model組小鼠相對于control組小鼠停留于轉棒上的時間明顯減少，差異有統計學意義(F=12.533,P<0.05)，見圖2A；訓練到第7天時，與model組比較，5 mg/kg NSS組和Y組能明顯提高轉基因小鼠停留于轉棒上的時間，差異有統計學意義(F=21.587，P<0.05，P<0.01)，見圖2B；訓練到第12天時，與model組比較，2 mg/kg NSS組能明顯提高轉基因小鼠停留于轉棒上的時間，差異有統計學意義(F=10.902，P<0.05)，見圖2C，AM630能明顯逆轉NSS作用。

2.3 NSS對APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力的影響隨著訓練天數的增加，小鼠通過學習和記憶尋找水下平臺時間不斷縮短。訓練到第6天時，與model組小鼠比較，5 mg/kg NSS組和Y組尋找水下平臺時間逐漸縮短，差異有統計學意義(F=4.904，P<0.05)，見圖3A，訓練到第7天時，與model組小鼠比較，5 mg/kg給藥組和Y組的小鼠水下平臺的尋找時間進一步縮短，差異有統計學意義(F=14.597，P<0.05，P<0.01)，見圖3B；訓練到第11天時，與model組比較，2 mg/kg NSS組能明顯縮短轉基因小鼠尋找水下平臺的時間，差異有統計學意義(F=4.445，P<0.05)，見圖3D，AM630能明顯逆轉NSS作用。

訓練到第14天后，撤除水下平臺進行探索性實驗。與model組比較，NSS組(2 mg/kg，5 mg/kg)和Y組小鼠在第Ⅲ象限中停留時間明顯增加，差異有統計學意義(F=8.721，P<0.05，P<0.01，P<0.001)，見圖3C。AM630能逆轉NSS作用。

2.4 NSS降低APP/PS1轉基因小鼠腦組織中Aβ水平如圖4所示：與control組比較，model組的腦部海馬組織中Aβ42及Aβ40的含量顯著性升高，差異有統計學意義(F(Aβ42)=10.727,F(Aβ40)=8.229，P<0.01，P<0.001)。與model組比較，NSS組能顯著降低Aβ42及Aβ40的含量，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。加入CB2受體拮抗劑AM630能逆轉NSS作用，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 NSS對APP/PS1轉基因小鼠運動能力的影響

A：第6天疲勞轉棒儀實驗；B：第7天疲勞轉棒儀實驗；C：第8～14天疲勞轉棒儀實驗；1:control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；6：NSS 1 mg/kg+AM251組；7：NSS 2 mg/kg+AM251組；8：NSS 5 mg/kg+AM251組；9：NSS 1 mg/kg+AM630組；10：NSS 2 mg/kg+AM630組；11：NSS 5 mg/kg+AM630組；12：AM251組；13：AM630組；14：Y組；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NSS 2 mg/kg組比較：#P<0.05；與NSS 5 mg/kg組比較：▽P<0.05

圖3 NSS對APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力的影響

A：第6天定位航行實驗;B：第7天定位航行實驗；C：空間探索實驗；D：第8～14天定位航行實驗;1:control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；6：NSS 1 mg/kg+AM251組；7：NSS 2 mg/kg+AM251組；8：NSS 5 mg/kg+AM251組；9：NSS 1 mg/kg+AM630組；10：NSS 2 mg/kg+AM630組；11：NSS 5 mg/kg+AM630組；12：AM251組；13：AM630組；14：Y組；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NSS 2 mg/kg+AM630組比較:#P<0.05；與NSS 5 mg/kg+AM630組比較:▽P<0.05

圖4 NSS和AM630對APP/PS1轉基因小鼠腦部海馬組織中Aβ40及Aβ42含量的影響

1：control組；2：model組；3：NSS組；4：NSS+AM630組；5：AM630；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與NSS組比較：#P<0.05

2.5 NSS對APP/PS1轉基因小鼠腦組織中CB2蛋白表達的影響與control組比較，model組海馬組織中CB2蛋白表達明顯下調，NSS能逆轉上述現象，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5。

圖5 NSS對APP/PS1轉基因小鼠腦部海馬組織中CB2蛋白表達的影響

1：control組；2：model組；3：NSS 1 mg/kg組；4：NSS 2 mg/kg組；5：NSS 5 mg/kg組；與model組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

APP轉基因小鼠最早用于AD模型小鼠，主要模擬腦內Aβ斑塊形成過程，PS轉基因小鼠使用較少，其常作為一種條件致病基因，協助其他相關基因的表達，使得模型小鼠病理改變更加明顯，APP/PS1轉基因小鼠是最能模擬人AD腦內區域性與特異性的病理改變[7]。

本實驗首先從整體動物水平對APP/PS1轉基因小鼠的運動及學習記憶能力進行評價，選用石杉堿甲作為陽性對照組，原因為其可用于各型癡呆、記憶認知功能及情緒行為障礙[8]。從動物行為學實驗中發現，NSS能改善小鼠行為學異常現象，2 mg/kg和5 mg/kg有顯著性差異，1 mg/kg無此作用。提示NSS的作用存在于一定劑量范圍內，劑量偏低可能影響其對腦組織的保護作用。在開場實驗中，NSS對轉基因小鼠的運動總路程以及在角落、邊緣及中央區域的運動時間都無影響，表明NSS對小鼠的自主活動并無影響。在疲勞轉棒儀和水迷宮實驗中，隨著訓練天數的增加，NSS能提高轉基因小鼠的活動能力，表明小鼠的精神活動表現良好，協調及抗疲勞能力增強，并能增強其學習記憶能力，提示NSS提高小鼠在轉棒上的協調能力，有可能與其學習記憶能力增強有關。CB2受體抑制劑AM630逆轉NSS的作用，而AM251無此作用，表明NSS通過CB2受體改善轉基因小鼠行為學異常，CB1受體并未參與到NSS的作用中。

老年斑是AD的主要病理改變之一，Aβ1- 42是構成老年斑重要的組成部分[9]。本研究顯示NSS降低轉基因小鼠腦組織中Aβ42及Aβ40的水平，AM630能逆轉NSS的作用，提示NSS通過CB2受體調控Aβ42及Aβ40水平，與行為學實驗趨勢一致。

CB2受體參與多條生理病理進程，表現出較好的神經保護活性[10]。研究發現NSS在低、中、高劑量均能上調CB2受體的表達，表明NSS可能通過CB2受體改善小鼠行為學異常及降低Aβ40和Aβ42的水平。在動物行為學實驗中，NSS在低劑量組無作用，而NSS在低劑量時能上調CB2受體，可能因為個體的差異性引起低劑量組行為學不穩定，低劑量的NSS不足以改善行為學異常，同時也表明NSS在不同劑量下顯示不同的藥理效應。NSS是否直接激動CB2受體需要后期進一步研究。

本研究顯示，NSS能明顯改善小鼠學習記憶能力，提高小鼠的運動協調及抗疲勞能力，同時降低Aβ42和Aβ40的水平，此過程可能依賴于CB2受體。