轉化人參皂苷菌株的篩選及活性初步鑒定

賈桂燕　潘昉　劉玉鵬　李晶瑩　王維峰　孫工兵　葛文中　張月瑩

摘 要：實驗從吉林省長白山、通化市榆林鎮、懷化白山市撫松縣3地的鮮參根際土壤中篩選具有轉化人參皂苷生物活性的微生物，平板劃線法篩選單菌落菌株，人參總皂苷為底物經液體發酵，經薄層色譜分析初步判斷具有轉化活性的菌株，采用紫外分光光度法測定活性菌株對人參皂苷的轉化率。最終篩選出8株真菌菌株，其中C4轉化活性最高，可使人參皂苷的轉化率提高28.92%。

關鍵詞：人參皂苷;微生物轉化;薄層層析法;紫外分光光度法

中圖分類號 TQ929文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）15-0028-04

Screening of Transformed Ginsenosides Strains and Preliminary Identification of Their Activities

Jia Guiyan1 et al.

（1College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319，China）

Abstract：In this experiment，there are eight fungi strains were selected from rhizosphere soil of fresh ginseng in Changbai Mountain of Jilin Province，Yulin Town of Tonghua City and Fusong County of Huaihua City，which had bioactivity of transforming ginsenoside.Through thin layer chromatography analysis，preliminary judgment has the activity of the strains，again by Ultraviolet spectrophotometric method determination of active strains of ginseng saponin conversion rate.Among them，C4 showed the highest conversion activity，which could increase the conversion rate of ginsenosides by 28.92%.

Key words：Ginsenoside;Microbial-Transformation;Thin-layer-Chromatography;UV spectrophotometry

人參（Panax ginseng C.A.Mey）是我國傳統珍貴的藥用植物之一，作為幾千年來應用最廣泛的中草藥之一，在東方醫學史上占有重要地位[1]。味甘，微苦，性質溫和，具有調氣血、滋補身體的作用，被譽為“中草藥之王”[2，3]。人參皂苷是人參的主要藥理活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗癌等作用[4-6]。由于天然人參皂苷含量較低，利用化學和生物方法對人參皂苷進行定向轉化，對于制備人參皂苷有著重要意義。

目前，人參皂苷的轉化方法主要有微生物轉化和酶轉化2種[7，8]。酶轉化法有一定的特異性，β-葡萄糖苷酶是酶轉化法最常用的一種酶。微生物轉化不同于酶轉化，以簡單的培養方式、多樣的種類和豐富的酶系統成為生物轉化中最常用的生物，其轉化過程一般為：細菌篩選—培養轉化底物—薄層色譜分析—紫外（高效液相）檢測。近年來，學者們對人參皂苷的微生物轉化途徑和產物進行了研究，為轉化人參皂苷奠定了基礎[9，10]。微生物轉化不僅具有環境污染程度低、成本低的優點，而且具有較高的特異性，是一種選擇性、環保性技術[11]。應用微生物方法對天然人參皂苷糖基的結構進行改變，大大提高了其生理活性和應用價值，將其應用于工業生產具有重要的意義[12-14]。

本實驗通過平板劃線法從長白山、榆林鎮、撫松縣3個產地的鮮參根際土壤稀釋液中篩選出22株真菌菌株，根據其形態、顏色，最終合并為8株菌株，采用液體發酵法以人參總皂苷為底物進行轉化，經薄層色譜分析法初步確定具有轉化能力的活性菌株，利用紫外可見分光光度法測定發酵液吸光度值[16]，考察人參總皂苷的轉化情況，繼而得到轉化活性最佳的活性菌株。

1 儀器與材料

1.1 儀器 詳見表1。

1.2 試劑 瓊脂粉（北京澳博星生物技術有限責任公司）、葡萄糖（沈陽市華東試劑廠），硅膠板GF254（青島海洋化工廠分廠），pH試紙（天津市金達化學試劑有限公司），甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司），乙醇（天津市永大化學試劑有限公司），三氯甲烷（北京化工廠），正丁醇（天津市百世化工有限公司），均為分析純。濃硫酸、香草醛、冰乙酸、高氯酸均為分析純，購買于天津市大茂化學試劑廠。

1.3 材料 帶土鮮參分別購買于吉林省長白山，通化市榆林鎮，懷化白山市撫松縣3個地區（均為5年參）;人參總皂苷Re標準品購買于合肥博美生物科技有限公司;實驗所用底物人參莖葉總皂苷購買于遼寧省生物醫藥研發中心。

2 方法

2.1 培養基的制備 培養液pH控制在7左右，用1mol/L的氫氧化鈉溶液進行調節控制。制備的培養基以及培養皿等均在121℃的高溫下滅菌25min。

2.1.1 馬鈴薯固體培養基（PDA培養基） 將馬鈴薯去皮，洗凈并切成1cm3的小塊，用天平稱取200g，加入1000mL的蒸餾水和20 g瓊脂粉，一起煮沸約20min后土豆塊熟而不爛，停止加熱[16]。用紗布過濾，將濾液倒入1000mL的燒杯中，再向濾液中加入20g葡萄糖，用玻璃棒攪拌溶解，最后加蒸餾水定容到1000mL。

2.1.2 馬鈴薯液體培養基（PDB培養基） 配置方法同上述PDA培養基配置法相同，加入葡萄糖和人參總皂苷底物，再分裝置250mL錐形瓶中，包好，放置121℃高溫滅菌鍋中25min[16]。滅菌后取出放入4℃左右冰箱冷藏保存。

2.1.3 斜面培養基 將PDA培養基趁熱倒入試管中，使試管傾斜成斜面，使之凝固，4℃左右冰箱冷藏保存。

2.1.4 平面培養基 均勻將PDA培養基倒入培養皿中，平鋪培養皿底部即可。

2.2 鮮參根際土壤真菌的分離 采用稀釋平板法進行土壤分離。取長白山、榆林鎮、撫松縣3個地方的土壤放置于40～ 50℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干2～3h。分別取1g烘干土壤，在超凈臺上各加入10mL無菌蒸餾水，將土樣從10-1稀釋至10-6倍[16，17]。充分震蕩搖勻。再將稀釋液逐級取0.1mL用無菌三角棒均勻涂布在含有PDA平板培養基上。在30℃的恒溫培養箱中培養2～3d。每24h觀察并記錄。結果顯示，能培養出菌株的土壤稀釋液通常為10-4～10-6。

2.3 菌種的純化 利用單菌落劃線法，將培養獲得的菌種進行純化。在超凈臺上用接種環挑取單菌落在含有卡那霉素（50μg/mL）PDA培養基上進行劃線，30℃倒置培養48h后得到較純的菌落。再經反復劃線培養，每隔24h取出觀察，直至得到單一的菌株，取出后，在無菌操作臺上用接種環傳至含有卡那霉素（50μg/mL）PDA斜面培養基上，置于30℃電熱恒溫培養箱中培養72h，4℃保藏，備用。

2.4 液體發酵培養 將純化后的平板培養基中的菌株用2mL無菌蒸餾水沖洗制成孢子懸液，分別加入含有人參總皂苷的PDB培養基中（人參總皂苷的含量為0.4mg/mL，以相同濃度及體積的人參總皂苷溶液的無菌株液體培養基作為空白對照），置于30℃，160r/min[18～20]條件下全溫振蕩器搖晃12d。培養48h后，每隔24h取發酵液，用水飽和正丁醇V∶V=1∶1萃取，6000r/min離心10min，取上清液，備用。

2.5 薄層色譜初步鑒定活性菌株 層析條件：硅膠板GF254，100×100mm;展開劑：三氯甲烷∶甲醇=3∶1，臨用前配制。取2.4項下制備的上清液，用微量點樣器分別定量吸取對照品及供試品溶液，在離層析板邊緣1.5cm處精確點樣，點于同一硅膠板，展開劑展開，吹干溶劑，噴10%硫酸乙醇溶液，110℃均勻加熱10min至斑點顯色清晰[21，22]。置于日光與紫外燈光365nm下分別驗視，通過與空白對照人參皂苷所顯示的斑點對比判斷經微生物轉化后樣品中所含皂苷成分的轉化情況。

2.6 紫外分光光度法檢測活性菌株轉化率 人參總皂苷含量測定標準曲線的制備：精密稱量人參皂苷Re標準品溶液（0.5mg/mL）0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35mL于試管中，60℃水浴鍋中蒸干，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸、0.8mL高氯酸溶液，水浴鍋中加熱15min，冷卻，加入5mL冰醋酸溶液，搖勻[23]。以相應的試劑作空白對照，540nm處測吸光度，以標準品人參皂苷Re樣品量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。紫外分光光度法測定2.4項下所制備上清液的吸光度值，代入標準曲線，計算人參皂苷的含量及轉化率。計算公式為：轉化率（%）=（樣品量-空白樣品量）/空白樣品量×100。

3 結果與分析

3.1 菌種的純化 經反復劃線培養從土壤稀釋液中篩選出22株菌種，通過觀察其形態、顏色，將其合并為8種菌株。其中，C1號菌株為淡黃色菌株，C2號菌株為白色菌株，C3號菌株為黃白色菌株，C4號菌株為青綠色菌株，Y5號菌株為青綠色菌株，Y6號菌株為白色菌株，H7號菌株為黃白色菌株，H8號菌株為青綠色菌株，如圖1所示。（以該地區的首字母進行依次編號，C為吉林長白山，Y為榆林鎮，H為懷化市，編號與圖一一對應）。

3.2 薄層色譜分析活性菌株 發酵萃取液經薄層層析（TLC），與空白對照比較，菌株C2、C3、C4、H8的部分斑點與空白對照對應斑點對比，明顯較其形狀大、顏色深，初步判斷該菌株具有轉化提高人參單體皂苷含量的活性。部分TLC結果如圖2所示。空白對照、C1、C2、C3、C4、Y5、Y6、H7、H8編號與圖上編號一一對應。

3.3 活性菌株的轉化率 人參總皂苷含量測定標準曲線如圖3所示，回歸方程為：Y=4.2624X+0.0269，R2=0.9996。結果顯示，人參皂苷Re在0.05～0.175mg范圍內呈現出良好的線性關系。

采用紫外可見分光光度法，測定菌液上清液的吸光度值，計算各菌株對于人參總皂苷的轉化率，以培養天數為橫坐標，以各菌株轉化率為縱坐標，結果如圖4所示。由圖4可知，自吉林長白山鮮參根際土壤中分離出的1株菌株C4對人參總皂苷的轉化率達28.92%。隨著培養時間的增加，菌株C1轉化率逐漸升高，第6天達到最高值為24.41%，之后轉化率逐漸下降;菌株C2第4天轉化率達到最高值為21.53%，之后轉化率下降，人參皂苷被分解;菌株C3、Y5、Y6、H7轉化率不高，菌株H8前7d趨于平穩轉化，而在第9天達到轉化最高值為25.89%，之后幾天轉化率卻急速下降，而菌株C4的轉化能力較為穩定且第11天轉化率最高，為28.92%。

4 結論與展望

4.1 結論 本實驗從鮮參根際土壤中最終篩選出8株真菌，TLC法初步判斷出，具有轉化人參皂苷能力的活性菌株有4株，其中菌株C4經進一步采用紫外分光光度法檢測其總皂苷轉化率最高為28.92%。

4.2 展望 本實驗通過紫外分光光度法檢測菌株發酵液的吸光度，僅能判斷人參總皂苷的含量變化，而采用TLC法初步判斷人參皂苷的含量變化結果顯示，與空白對照比較，部分單體皂苷斑點顏色明顯加深，說明該菌株有定向轉化單體人參皂苷的活性，應繼續采用高效液相色譜（HPLC）對其發酵液進行分析，確定對何種單體皂苷定向轉化及轉化率。最后，應進一步對活性菌株的培養條件、培養時間等發酵條件進行優化，以進一步提高轉化率。

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（責編：張宏民）