吡羅紅、甲基綠與核酸染色反應實驗探究

敖 蘭 郝連振 王紅蕊

（1 保定市第一中學 河北保定 071000 2 石家莊第十五中學 河北石家莊 050000）

人教版生物必修1《分子與細胞》中，第2 章“組成細胞的分子”第3 節安排了一個實驗——“觀察DNA 和RNA 在細胞中的分布”。該實驗實現了從初中宏觀、個體層面的教學到高中微觀、分子水平的教學轉折，但在實際教學中該實驗的開出率及成功率都不盡人意。本文在大量實驗探究的基礎上，進行了4 個方面的改進：降低藥品濃度、改變藥品配方和實驗類型、簡化操作步驟、更換實驗材料，從而使實驗現象更清晰，更易于學生操作，成功率更高。

1 改進原因

該實驗源自大學生物學專業（尤其是醫學專業）的一個常規實驗——“Brachet（布拉奇特）反應”，吡羅紅和甲基綠的混合染液稱為“Unna（溫納）”試劑。該方法出現于1901年，Unna［1］在1910年又對試劑進行了改良，使實驗效果更加明顯，所以這是個成熟的實驗。自2004年選入高中生物學教材以來，有關該實驗改進的文章也頻頻出現，但對該實驗在高中階段的開展都沒有實質性的影響。

1.1 教材描述不清楚 教材是這樣表述的：“吡羅紅甲基綠染色劑取A 液20 mL、B 液80 mL 配成染色劑，使用時現用現配。A 液：取吡羅紅甲基綠粉1 g，加入100 mL 蒸餾水中溶解，放入棕色瓶備用。”這段描述只說吡羅紅甲基綠粉1 g，沒說明吡羅紅甲基綠的比例，而通常購買的是分裝的吡羅紅粉和甲基綠粉。

1.2 實驗費用偏高 以上海Regal Biotechnology Company提供的報價來看，該實驗所需的2 種藥品的價格分別為：5 g 吡羅紅370 元、10 g 甲基綠178 元，這2 種藥品在高中生物學常規實驗中是費用最高的。按照教材配方，假定吡羅紅甲基綠的比例是1∶1，A 液20 mL、B 液80 mL 配成染色劑，每瓶吡羅紅（5 g）和甲基綠（10 g）能配5 000 mL溶液。現階段高中生物學實驗室通常是按照28 組配備，按每年級20 個班計算，有的學校購買一次藥品只能做1～2 次學生實驗。

1.3 實驗效果不能保證 選取該實驗時，完全按照大學教材中的操作方法引進。而大學一般是按照制作玻片標本的步驟進行操作。玻片標本制作步驟如下：取材、固定、沖洗、染色、脫水、透明、封片，每步都有相應的時間，步驟不能簡化、時間不能縮短、濃度不能降低，否則其制作的標本達不到最佳的觀察效果且不能長期保存［2］。大學的實驗課通常都是按照半天時間安排，可按照操作步驟進行，實驗效果也不會出問題，而高中實驗課只有40 min 或45 min，時間有限，無法保證實驗的效果。

2 改進方案

2.1 降低藥品濃度 針對多數學校出現染色較深，細胞核呈現紅色而不是綠色的情況，筆者嘗試降低藥品的濃度。利用梯度法，甲基綠從2%開始降低濃度進行配制，吡羅紅從5%開始降低濃度進行實驗，最終確定染色效果最佳的最小濃度為：甲基綠0.03%，吡羅紅0.03%。從而減少了染料使用量，降低了實驗成本。

2.2 改變藥品配方 Brachet 反應主要是利用核酸分子上的磷酸根（-PO43-）和堿性染料形成鹽鍵而在原位沉淀顯色，DNA 和RNA 都有磷酸根（-PO43-），故能同時和堿性染料結合。由于DNA 分子和RNA 分子的聚合程度有差別，Unna 試劑中的甲基綠優先和DNA 分子相結合，而吡羅紅更多地與RNA 分子相結合，從而表現出不同的顏色，顯示細胞內RNA 與DNA 的分布位置［3］。

然而筆者按照有些資料介紹的吡羅紅甲基綠比例進行操作，細胞核和細胞質都呈現紅色，沒有體現甲基綠的顏色。因此改變了2 種染料的使用比例，分別按照吡羅紅∶甲基綠為3∶1、2∶1、1∶1 的比例操作，最終確定當比例為1∶1 時，能觀察到清晰的綠色的細胞核。

2.3 簡化操作步驟 教材以口腔上皮細胞為實驗材料，但口腔上皮細胞在顯微鏡下數量少、體積小、染色不充分，從而不易觀察。于是筆者用洋蔥內表皮細胞作為實驗材料，省略了針對口腔上皮細胞進行的烘干操作。

其次，由于該反應對酸堿度敏感，而緩水流沖洗不能徹底去除鹽酸，因此嘗試將材料直接放在染液中進行染色，結果現象更加清晰，從而去掉水解和緩水流沖洗2 個步驟。這樣實驗步驟從6 個減少為3 個，即為制片、染色、觀察，極大節省了時間，有利于學生在有限時間內對實驗進行思考和討論。

2.4 改變實驗類型 在該實驗中，為何要用吡羅紅和甲基綠混合染劑染色，而不是先用一種染劑再用另一種染劑染色？也是一個重要的考點。為了讓學生通過探究理解這一問題，筆者改變了實驗類型，將觀察實驗改為探究實驗。將實驗分為4組：分別用甲基綠染劑、吡羅紅染劑、甲基綠和吡羅紅混合液（體積比1∶1）和加入pH=4.8 緩沖液的甲基綠吡羅紅混合液對洋蔥表皮細胞進行染色觀察。

3 改進后的實驗操作

實驗試劑：0.03%甲基綠染液，0.03%吡羅紅染液（甲基綠粉和吡羅紅粉均購買自上海Regal Biot-echnology Company，2009年生產），pH=4.8 緩沖液（以下染液濃度均為0.03%，不再重復說明）。

實驗用具：數碼顯微鏡、普通顯微鏡、載玻片、蓋玻片、牙簽、鑷子等。

實驗材料：洋蔥內表皮。

實驗時間：40 min。

實驗步驟：①制片。

表1 實驗分組

取2 個載玻片，第1 個載玻片的左、右2 個位置分別滴加1、2 組染液各1 滴,第2 個載玻片的左、右2 個位置分別滴加3、4 組染液各1 滴；在每種試劑里分別加入洋蔥內表皮并用鑷子展開（如果先將洋蔥內表皮展開在載玻片上，其易因干燥而卷在一起；如果將洋蔥內表皮先用清水濕潤，則會改變試劑濃度）；蓋上蓋玻片并用吸水紙吸去多余試劑。

②觀察。制好裝片后，即可進行觀察；數碼顯微鏡用于在前臺為學生展示理想的實驗效果，并比較分析4 組實驗現象。

4 實驗結果

在40 倍物鏡下，觀察得到如圖1～圖4（本文附圖見封四）所示圖像。由于簡化了實驗步驟，改變了實驗類型，學生在有限的一節課的時間里，能更充分地進行思考討論。以下是遵循對照原則，進行的實驗結果分析：①通過1、2 組對照，學生強化了對甲基綠和吡羅紅都能使DNA、RNA 染色的認識；②通過1、2、3 組對照，學生得出甲基綠和吡羅紅與核酸的結合程度有差異； ③通過3、4 組對照，學生得出該顏色反應對酸堿度敏感的結論。

5 實驗拓展

最后，筆者用該試劑，按照教材中“有絲分裂觀察”的實驗步驟對大蒜根尖進行染色，結果如圖5和圖6（40 倍物鏡），發現實驗現象比教材中龍膽紫染色更為清晰。

總之，通過該實驗方法的改進，筆者深切體會到任何實驗都有它的局限性，當受到外界條件影響時，可能會出現不合預期的問題。作為一線工作者要因地制宜，在把握實驗原理不變的前提下，勇于探究實驗方法，更好地為實驗教學服務，使學生的觀察能力、操作水平得到提升，邏輯思維能力和思維拓展能力得到進一步鍛煉。