利用蝸牛消化酶獲得植物原生質體*

楊 令 曹祥華

（1 北京師范大學蕪湖附屬學校 安徽蕪湖 241080 2 懷寧縣高河中學 安徽懷寧 246121）

植物原生質體是除去細胞壁后被原生質所包圍的“裸露細胞”。植物細胞被細胞壁包裹時呈不規則形態；去除細胞壁后，呈圓球形。原生質體是開展基礎研究的理想材料，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應用前景。原生質體融合是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，不僅能克服遠緣雜交有性不親和障礙，也可避免傳統的通過有性雜交誘導多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠緣基因導入栽培種中。原生質體融合技術可望成為作物改良的有力工具之一［1］。

獲取植物原生質體的方法有機械法和酶解法。其中酶解法是一種常用的技術，其原理是，植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁［1］，而得到植物原生質體。為了保持無細胞壁的原生質體的活力和膜穩定性，酶液的滲透壓必須與處理的細胞的滲透壓相近。

1 創新背景

人教版高中生物學選修3 教材中提及通過酶解法獲取植物原生質體。高中階段涉及有關酶的實驗，往往采用的都是活性材料，筆者嘗試從活體蝸牛中提取蝸牛酶制備植物原生質體，有助于學生直觀地觀察和研究原生質體。

蝸牛是一種植食性動物。蝸牛酶是從蝸牛消化道里提取出來的一種混合酶系，包含纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多種混合酶。為了獲取蝸牛的消化酶，可對蝸牛進行活體解剖，摘取嗉囊和消化道，收集消化液。然后對植物細胞進行處理，降解其細胞壁獲得原生質體。

綜上所述，本研究主要包括2 個實驗，即蝸牛的活體解剖實驗和原生質體的制備與觀察。

2 材料與方法

2.1 實驗材料 菠菜或其他蔬菜的幼葉、白玉蝸牛消化道和嗉囊。

2.2 實驗試劑 配制13%細胞-原生質體清洗液（CPW 洗液）：2×10-4mol／L KH2PO4、1×10-3mol／L KNO3、1×10-2mol／L CaCl2、2.05×10-3mol／L MgSO4、1×10-6mol／L KI、1.5×10-8mol／L CuSO4、13% W／V甘露醇pH=6.0。

其中，13%甘露醇使植物細胞質壁分離，有助于酶解細胞壁；鈣離子能穩定細胞膜的活性。CPW洗液沖洗蝸牛消化道，獲取溶解有消化酶的混合液［2］。混合液處理葉肉細胞后，可洗脫原生質體，維持滲透壓保持原生質體的正常形態。

2.3 實驗器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、注射器、鑷子等。

2.4 實驗步驟

2.4.1 蝸牛的活體解剖

1）實驗材料的預處理。從花鳥寵物市場購買白玉蝸牛若干，饑餓2～3 d，用清水沖洗干凈；將蝸牛置于燒杯中，注滿清水，加入少許乙醚；麻醉處理后的蝸牛軟體部分伸展，便于解剖和觀察。

2）去殼。用手術剪從殼口開始沿著縫合線，順著蝸牛殼螺旋的方向剪開殼，直至殼頂；在剪的過程中，蝸牛殼會慢慢脫落下來，用鑷子邊剪邊將碎殼除凈。蝸牛的軟體部分附著在殼軸上，小心將其從殼軸上取下。剪時注意不要破壞蝸牛的軟體結構。去殼后的蝸牛如圖1所示。

圖1 蝸牛去殼

3）解剖。將去殼的蝸牛軟體部分置于蠟盤中，分別在蝸牛頭部兩側和足的后部，插入1 根大頭針固定于蠟盤中。

將手術剪插入呼吸孔中，順著領與頭部體壁連接處，剪開外套膜。然后調轉剪刀方向，順著外套膜與身體的連接處，稍偏直腸的下緣剪開外套膜，將直腸保留在剪開的外套膜上。

蝸牛的口位于身體前端的頭部腹面, 口后肌肉質球狀結構稱為口球, 口球內有攝食器官顎片和齒舌；口球后與食道相連,食道處與膨大的嗉囊相連； 嗉囊背部有2 個淡黃色分支的管狀腺體稱為唾液腺，唾液腺由唾液腺管直接通入食道；嗉囊后面稱為后食道,直通胃,胃呈袋狀；小腸比較長,在內臟囊中迂回盤旋,小腸后面與直腸相接；肛門開口位于身體體右側近外套腔出口處。順其消化道剪開體壁剝離消化道（圖2），摘取嗉囊。放在pH=5.0 的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液中。

2.4.2 提取蝸牛消化酶 用注射器吸取13% CPW 洗液5 mL，從消化道的一端插入，反復注射幾次。使蝸牛消化道里的消化酶充分洗脫后，置于離心管中待用［3］。

2.4.3 用蝸牛消化酶提取原生質體 取幼嫩的菠菜葉，小心用鑷子撕取下表皮，暴露葉肉組織。剪取幾小塊葉肉組織置于蝸牛消化酶離心管中，酶解1～2 h，過程中可稍微晃動幾次。

圖2 蝸牛消化道分離

2.4.4 制作臨時裝片 取2 個潔凈的載玻片，用膠頭滴管從離心管中吸取酶解后的組織樣液，滴1 滴于載玻片的中央，輕輕蓋上蓋玻片。對照組為菠菜葉肉組織切片。

2.4.5 鏡檢 先在低倍鏡下找到原生質體（圖3），再換成高倍鏡仔細觀察，做好記錄。畫出在顯微鏡下看到的原生質體的圖像。

圖3 低倍鏡原生質體

3 結果

完整的原生質體形態上是圓球形，顏色鮮艷，富含細胞質。

實驗中所用材料主要是葉肉細胞，因此大部分原生質體均富含葉綠體； 個別原生質體可能是表皮細胞或保衛細胞形成，是無色的觀察不到葉綠體。原生質體的大小差異是源于植物體細胞的大小不同。一般生活著的原生質體均是圓球狀的，性狀扁或者不規則的，往往是死亡的。

4 討論

該方法具有條件溫和、原生質體完整性好、活力高、產率高等優點，但是使用蝸牛酶也存在一定的副作用。由于蝸牛酶是由多種酶組合成的復雜酶系，其中所含的蛋白酶等可能會對細胞膜產生不可逆的傷害，因此在實際科學研究中需要酌情考慮使用該方法。在高中階段，只需要體驗制備原生質體的過程和直觀觀察原生質體即可，無需考慮其他酶對實驗結果的影響。但是在實驗過程中一定要把握酶解的時間和溫度；時間過短，細胞壁分解不徹底；酶解時間過長，則可能會在其他酶作用下，原生質膜破裂而死亡；酶解的溫度過高或過低，細胞壁分離不徹底，將導致不能得到完整的原生質體。