連翹敗毒丸高效液相色譜指紋圖譜研究及聚類分析

許 翔

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院藥學科，福建 福州 350000）

連翹敗毒丸由連翹、金銀花、黃連、黃芩、黃柏、赤芍等19味中藥材組方，有清熱解毒、散風消腫功效，臨床主要用于治療臟腑積熱與風熱濕毒引起的瘡瘍初起、紅腫疼痛、憎寒發熱、風濕疙瘩、遍身刺癢、大便秘結[1]。本研究中建立了連翹敗毒丸的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結合聚類分析，為其質量控制和快速評價提供借鑒。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，包括在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、VWD-G1314C型檢測器、Chemistation數據處理系統）；AUW-220D型十萬分之一電子天平（日本島津公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

連翹苷對照品（批號為 110821-201816，含量95.1%），連翹酯苷A對照品（批號為111810-201707，含量97.2%），綠原酸對照品（批號為110753-201817，含量96.8%），黃芩苷對照品（批號為110715-201821，含量95.4%），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201814，含量 86.7%），漢黃芩苷對照品（批號為112002-201702，含量98.5%），芍藥苷對照品（批號為110736-201842，含量97.4%），均購于中國食品藥品檢定研究院；連翹敗毒丸（承德天元藥業股份有限公司，批號分別為 171019，171222，180126，180222，180319，180408，180513，180619，180910，181021，181107，181126，編號為 S1 ～ S12，規格為每袋 9 g）；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[2-3]

色譜柱：YMCHydrosphere-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5% 磷酸溶液（B），梯度洗脫 （0～16 min、16%A→25%A，16～30 min、25%A→38%A，30～40 min、38%A→59%A，40～54 min、59%A→80%A，54～62 min、80%A→16%A）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：328（0～16 m），220 nm（16～40 min），277 nm（40 ～62 min）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別稱取連翹苷、連翹酯苷A、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷的對照品各適量，精密稱定，以甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為 2.245 6，2.001 7，1.113 4，0.582 7，0.511 9，1.201 2，0.894 1 mg/mL的混合對照品溶液，冷藏避光保存。

供試品溶液：取裝量差異項下的內容物，研細，取約2.5 g，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加入30 mL甲醇溶液，室溫超聲（功率450 W，頻率40 kHz）處理40 min后取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

方法學考察：按標準進行方法學考察，結果精密度、穩定性、重復性試驗結果的RSD均小于2%，表明儀器精密度、方法重復性良好，供試品溶液室溫放置24h內穩定。

指紋圖譜的建立及相似度分析：取12批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，測定，得HPLC圖譜，導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A版）軟件，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1和圖2。S1～S12號樣品與對照圖譜的相似度分別為0.989，0.971，0.967，0.992，0.909，0.981，0.988，0.974，0.979，0.994，0.993，0.989，均大于 0.9。在 23 個共有峰中，12號峰的面積最大，峰位居中，分離完全，通過與混合對照品圖譜對照，指認出其為連翹苷，設為參照峰（S），計算其他共有峰對12號峰的相對峰面積。詳見表1。

圖1 12批樣品HPLC疊加指紋圖譜

圖2 樣品HPLC對照指紋圖譜

共有峰指認：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A版）對12批樣品的HPLC圖譜進行比較分析。結果，可指認23個共有峰中的7個成分，分別為綠原酸（3 號峰）、芍藥苷（8 號峰）、連翹苷（12 號峰）、連翹酯苷A（14號峰）、鹽酸小檗堿（15號峰）、黃芩苷（19號峰）、漢黃芩苷（20號峰）。混合對照品色譜圖見圖3。

2.4 聚類分析[4-5]

將12批樣品中23個共有峰的相對峰面積數據輸入SPSS 22.0統計學軟件，采用組間均聯法，以歐氏距離平方為測度，采用系統聚類分析法進行模式識別分析，結果見圖4。根據聚類分析樹狀圖，當類間距介于15～25時，12批樣品被分成了 3大類：S4、S10、S11為一類，S1、S2、S3、S6、S7、S8、S9、S12 為一類，樣品 S5 單獨為一類。聚類分析結果與相似度結果基本一致。

3 討論

現行質量標準僅對連翹敗毒丸的性狀、大黃的薄層和丸項下的通則檢查做了規定，難以全面評價其質量，文獻報道鮮有對其綜合質量的評價方法[6]。在中醫藥理論中，中成藥的藥效是各味藥發揮協同作用的結果，指紋圖譜可全面控制中藥內在化學成分的整體質量，它是以色譜峰的相對保留時間及相對峰面積來進行定性，以色譜峰面積進行定量，可作為分析中藥內部有效成分的技術[7-8]。

本研究中以12號峰（連翹苷峰）為參照峰，計算得的12批樣品23個共有峰的相對保留時間的RSD為0.05% ～1.10%（文中表略），均較小；而相對峰面積的RSD為 0.06% ～4.72% ，其中 7，18，21，23 號峰大于2.0%，峰面積的差異可能與原料藥材質量有關，不同產地和來源的藥材質量有很大差異，建議藥廠在選藥投料生成前應注意藥材成分含量的檢測。

本研究中曾采用二極管陣列檢測器行全波長掃描，為了實現連翹苷、連翹酯苷A、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷的同時測定，采用不同時段切換不同檢測波長：0～16 min時，在328 nm波長處測定綠原酸；16～40 min時，在220 nm波長處檢測連翹苷、連翹酯苷A及芍藥苷；40～62 min時，在277 nm波長處檢測黃芩苷、漢黃芩苷、鹽酸小檗堿。同時比較了乙腈和甲醇作為有機相，0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、0.5%磷酸溶液及水作為無機相的檢查效果，結果表明，以乙腈-0.5%磷酸溶液系統得到的指紋圖譜色譜峰數量多、信號強、分離效果好。研究過程中還比較了超聲提取、加熱回流提取及浸漬過夜提取3種提取方法的差異，結果提取率無明顯差異，但超聲提取時間短、操作簡便，故為了節約成本采用超聲提取法。

綜上所述，本研究中建立了連翹敗毒丸HPLC指紋圖譜，實現了對其多指標成分整體、綜合的客觀評價與分析，共識別出23個共有峰，并指認出其中7個指標性成分，能較好地反映出連翹敗毒丸內在質量信息，可為有效控制連翹敗毒丸的質量提供科學依據。

表1 12批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積

圖3 混合對照品溶液HPLC圖

圖4 12批樣品聚類分析樹狀圖