高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血塞通片中5種皂苷類成分含量*

李 敏，葉 慧，陳驍鵬，姜 瑋，吳 蕓

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300）

圖1 高效液相色譜圖

血塞通片主要成分為三七藥材中的三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)功效，其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]含量測(cè)定項(xiàng)以紫外-可見分光光度法測(cè)定三七總皂苷的含量[2]。本研究中建立了高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定血塞通片中5種皂苷類成分的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WatersAcquityArc高效液相色譜儀，包括Empower3工作站、四元梯度泵、2998型二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱（美國(guó)Waters公司）；8200型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；XS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)為110745-201318，含量94.0%），人參皂苷 Rg1對(duì)照品（批號(hào)為 110703-201530，含量 91.7%），人參皂苷 Re對(duì)照品（批號(hào)為110754-201626，含量 97.4%），人參皂苷 Rb1對(duì)照品（批號(hào)為110704-201424，含量93.7%），人參皂苷 Rd對(duì)照品（批號(hào)為111818，含量92.1%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；血塞通片（云南安特吶制藥股份有限公司，批號(hào)分別為 170516、160412、170937；湖南湘雅制藥有限公司，批號(hào)為1704101；昆藥集團(tuán)血塞通藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為161227；湖南紳泰春藥業(yè)有限公司，批號(hào)為 20150701、20160301）；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：XBridge C18柱（250 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：乙腈溶液（A）-水（B），梯度洗脫（0～20 min 時(shí)20%A，20～45 min時(shí) 20%A→46%A，45～55 min時(shí)46%A→55%A，55～60 min時(shí) 55%A，60～62 min時(shí)55%A→20%A，62～70min時(shí) 20%A）；流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：10 μL。各相鄰成分之間分離度較好（R＞1.5），理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)應(yīng)不低于5 000。

2.2 溶液制備

稱取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rd的混合對(duì)照品溶液。取樣品10片，除去包衣，稱定質(zhì)量，研細(xì)，混勻，取約40 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，溶解并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按樣品處方取缺三七總皂苷的適量賦形劑制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，在各待測(cè)成分峰處陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

線性關(guān)系考察：取混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，mg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 5個(gè)成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n=3）

定量限與檢測(cè)限考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）≥10測(cè)定各成分定量限，以S/N≥3測(cè)定各成分檢測(cè)限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd色譜峰面積的RSD分別為 0.34% ，0.25%，0.23% ，0.26%，0.24% （n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取同一供試品溶液（批號(hào)為170516），室溫下分別放置 0，2，4，8，12，16，20，24h 時(shí)按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的色譜峰面積的RSD分別為 0.83% ，0.56%，1.23%，0.78%，1.04%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)為170516）6份，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 的平均含量分別為每片 9.74，33.75，4.51，34.18，8.75 mg，RSD分別為 1.00% ，0.87% ，1.82% ，0.82%，0.77%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為170516），研細(xì)，稱取6份，每份約20 mg，精密稱定，再精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取7批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

采用甲醇作為提取溶劑，分別超聲30 min和直接溶解，進(jìn)樣，比較峰面積，結(jié)果直接溶解的提取率更高，可能是由于超聲過程中皂苷類分解加速，故選用直接溶解[3-4]。分別稱取 10，20，30，40，50 mg 樣品，直接溶解，進(jìn)樣，比較峰面積，結(jié)果40 mg的提取效率最高。

2015年版《中國(guó)藥典（二部）》西洋參藥材檢測(cè)中以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，結(jié)果人參皂苷Rd出峰太快，分離度差，且分離時(shí)間過長(zhǎng)。查閱有關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，發(fā)現(xiàn)大多選用乙腈-水為流動(dòng)相，同時(shí)血塞通片以三七總皂苷為原料藥，樣品色譜圖中雜質(zhì)峰相對(duì)較少，考慮到人參皂苷Rg1和人參皂苷Re分離度不佳，以及人參皂苷Rd極性小、出峰時(shí)間晚的問題，通過對(duì)梯度洗脫程序的調(diào)整，最終選用70 min的梯度洗脫系統(tǒng)。

綜上所述，本HPLC法簡(jiǎn)便可行，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定，可用于血塞通片中5種皂苷類成分的同時(shí)測(cè)定。