四波長融合指紋圖譜評價金卷升板膠囊質量*

王玲嬌 ，楊 亮 ，張振杰，于 靜△，楊繼章，孫國祥，周春華

（1.河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊 050031； 2.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016）

金卷升板膠囊源自河北醫科大學第一醫院血液科劉清池主任醫師經驗方，由金銀花、黃芩、地錦草、熟大黃等中藥材組方，有解毒散瘀、清熱涼血、止血通絡功效，主治原發性免疫性血小板減少癥（ITP）[1-2]。現有文獻多報道以高效液相色譜（HPLC）法測定處方中單味藥材代表成分及建立單味藥材單波長指紋圖譜[3-4]，未見該制劑的指紋圖譜報道。多波長融合指紋圖譜可清晰、完整地揭示處方中有效成分的復雜物質基礎，現已用于中藥成分分析[5-6]。本研究中建立了金卷升板膠囊的四波長融合指紋圖譜，并對其質量進行全面評價。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 Series型高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）；BS 110S型分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；微孔濾膜（上海興亞凈化材料廠）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110710-200110，含量98%），綠原酸對照品（批號為110756-200102，含量98%），黃芩苷對照品（批號為110755-200103，含量98%），蘆薈大黃素對照品（批號為110796-200802，含量98%），大黃素甲醚對照品（批號為110724-200613，含量98%），均購自中國食品藥品檢定研究院；金卷升板膠囊（河北醫科大學第一醫院，批號分別為170813、170826、170901、170914、170928、170834、170841、170855、170935、170959、170968，編號依次為 S1～S11，規格為每粒0.5 g）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.5% 乙酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min時 10%B→40%B，10～40 min時 40%B→70%B，40～55 min時 70%B→100%B，55～65 min時 100%B）；檢測波長：254，275，330，360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取沒食子酸對照品1.34 mg，綠原酸對照品6.19 mg，黃芩苷對照品6.46 mg，蘆薈大黃素對照品1.81 mg，大黃素甲醚對照品3.21 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得混合對照品溶液。取樣品內容物10粒，混勻，研細，取0.2 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入約10 mL 70%甲醇，超聲（功率300 W，頻率40 Hz）處理30 min，降至常溫后，加70%甲醇定容，搖勻，濾過，得供試品溶液。

2.3 方法學考察

按標準進行方法學考察，結果精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3%，表明儀器精密度、方法重復性均良好，供試品室溫下放置24 h內穩定。

2.4 四波長融合指紋圖譜分析

融合指紋圖譜建立：取11批樣品，依法制備11批供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，得HPLC圖譜，導入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統4.0版軟件，得HPLC指紋圖譜（見圖1）。以黃芩苷峰為參照物峰，確定65個共有峰，其中5號峰為沒食子酸峰，12號峰為綠原酸峰，37號峰為黃芩苷峰，49號峰為蘆薈大黃素峰，64號峰為大黃素甲醚峰，按照平均值法生成對照指紋圖譜（RFP），見圖1。

金卷升板膠囊質量評價：以生成的對照指紋圖譜為標準，采用系統指紋定量法依次計算11批樣品的宏定性相似度（Sm）、宏定量相似度（Pm）、均化系數（α）值，并區分金卷升板膠囊歸屬的質量等級（見表1）。結果11批樣品均為合格品。

圖1 11批金卷升板膠囊指紋圖譜與對照指紋圖譜（RFP）

表1 金卷升板膠囊指紋質量評價結果

兩種指紋圖譜質量評價結果比較：不同批次的金卷升板膠囊樣品在融合后和4個單波長下分別建立對照指紋圖譜，采用系統指紋定量法評價質量（見表1）。結果表明，指紋信號均化性與對照指紋圖譜差異較小，但單波長處指紋信息的不全會導致質量等級評價一致性偏好，且區分度小，而綜合了特征圖譜的融合譜的質量等級除S10外，其余均有所下降，但能更好地區別不同樣品的質量等級，使試驗結果更客觀真實。

3 討論

3.1 樣品提取方法選擇

預試驗比較了乙醇超聲提取法、浸泡法和回流提取法對有效成分的影響，結果回流提取法和浸泡法的指紋圖譜峰數量在4個檢測波長處均少于超聲提取法，且回流溫度過高，浸泡時間過長均導致主要成分相對含量下降，部分成分被破壞和分解，故最終選擇超聲法進行提取。

3.2 樣品提取溶劑選擇

預試驗中，比較了不同比例的甲醇、乙醇在超聲條件下提取的結果，發現甲醇提取的供試品溶液的色譜峰及分離度均優于乙醇，因此采用甲醇進行提取。70%甲醇提取的樣品在各個波長的主要成分色譜峰面積均大于30%甲醇、50%甲醇及80%甲醇，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。

3.3 融合指紋圖譜檢測波長確定

預試驗中對組方有效成分進行全波長掃描，最終選取254，275，330，360 nm這4個特征波長處的色譜圖進行融合。將11批樣品在4個波長下的色譜信號分別導入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數字化評價系統4.0版軟件[7-9]，以獲取較好的相似度和合適的指紋峰為評價標準，選取軟件計算的最大值在融合時間窗0.2 min時融合4個檢測波長下的色譜圖，得金卷升板膠囊各批次的融合指紋圖譜。

綜上所述，基于多波長融合技術的系統指紋定量法可為金卷升板膠囊的質量評價提供參考。