三種贛產葛地上部分總黃酮提取工藝優化及含量測定*

曾慧婷 李晶 陳超 何小群 陳星星 虞金寶 王小青

（江西省中醫藥研究院 南昌330046）

葛為豆科（Leguminosae）葛屬（Pueraria）多年生落葉藤本植物，始載于漢代《神農本草經》：“主消渴，身大熱、嘔吐、諸痹，起陰氣，解諸毒，味甘、辛、涼，歸脾胃二經”，列為上品[1]。在我國，葛屬植物約有11種，其中野葛和粉葛為我國資源較多、分布最廣、產量最高的葛屬植物，粉葛多為栽培，安徽、江西、浙江、四川、湖北、云南及湖南等地都有野生葛分布[2～3]。江西種葛、食葛歷史悠久，上饒市橫峰縣葛資源豐富、品種優良，享有“中國葛之鄉”的美譽[4]。現代研究表明，葛根有效成分主要有葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物，在治療心血管疾病、降血糖、抗腫瘤、抗菌抗病毒等方面表現出顯著的藥理活性[5～6]。此外，葛根尚含有豐富的葛根淀粉、蛋白質、人體所需的多種氨基酸和微量元素等，具有良好的食用價值，素有“北參南葛、亞洲人參”之稱，粉葛于2018 年新增入藥食同源目錄[7～8]。隨著葛根在醫藥和食品領域的需求量不斷增加以及中藥材產業扶貧行動計劃的貫徹落實，多地正引導貧困地區建立基地，發展大宗藥材和道地藥材的種植，促進貧困戶脫貧增收[9]。目前，江西各地已有一定規模的葛種植基地，然而對葛資源的利用仍然以其傳統藥用部位根部入藥或制作葛粉為主，葛花亦有見于解酒保肝之用，其地上部分的莖和葉在葛根采收過程中往往被廢棄，造成了資源的巨大浪費和生態環境的污染。明朝李時珍認為，葛的根、莖、葉、花和果均可入藥；現代研究亦證實，葛的莖、葉和花中尚含有豐富的異黃酮類化學成分，若加以利用，將產生可觀的經濟效益[10]。本研究基于中藥資源化學研究思路，對我院中藥資源普查工作中所收集的三種贛產葛根及其地上部分的總黃酮含量進行了測定，并對葛地上部分中總黃酮類化合物的提取工藝進行了優化，以期為葛地上部分資源的深入研究和開發利用提供參考依據。現報道如下：

1 材料與儀器

1.1 試劑與藥材 葛根素（批號1110752-201615，購于中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。藥材信息：三種贛產葛根類及其地上部分樣品10 批，均為本課題組開展中藥資源普查過程中所收集，均經江西省中醫藥研究院虞金寶研究員鑒定。樣品1～4 為2017 年9 月在資溪縣馬頭山國家級自然保護區采集的野葛P.lobata（Willd.）Ohwi 的根、莖、葉和花；樣品5～7 為2018年8 月由江西綠色生態葛研究所（橫峰縣蓮荷鄉）提供的一年生贛葛2 號（粉葛P.thomsonii Benth.）根、莖和葉；樣品8～10 為2018 年8 月在黎川縣德勝鎮采集的野葛P.lobata（Willd.）Ohwi 根、莖和葉，60℃烘干至恒重，粉碎過4 號篩，干燥保存。見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器與設備 SimplicityTM個人型超純水系統（德國默克密理博公司）；CQ-250 超聲波清洗器（上海船舶電子設備研究所）；AG-135 電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SHIMADZU UV-2450 紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速中藥粉碎機YF-1000（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

2 方法與結果

2.1 葛不同部位總黃酮的含量測定

2.1.1 供試品溶液制備 精密稱取編號1～10 樣品粉末（過4 號篩）各1 g，置于100 ml 具塞錐形瓶中，精密加入40 ml 80%乙醇，精密稱重，90℃回流1 h，放冷，補足失重，過濾合并濾液，精密量取續濾液1 ml，置于50 ml 棕色量瓶中，加水至刻度并搖勻，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取葛根素對照品5.95 mg，置于10 ml 棕色容量瓶中，加80%乙醇適量，超聲使其溶解后放冷，加80%乙醇至刻度并搖勻。精密量取2 ml，置于10 ml 棕色容量瓶中，加80%乙醇至刻度并搖勻，即得濃度為119 μg/ml 的對照品儲備液。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密吸取葛根素對照品儲備液1 ml 置10 ml 容量瓶中，加80%乙醇溶液至刻度，搖勻，靜置30 min 后，用紫外-可見分光光度計在200～500 nm 范圍內掃描，250 nm 波長下有最大吸收。見圖1。

圖1 對照品掃描圖譜

2.1.4 方法學考察 （1）線性關系考察：精密量取葛根素對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 分別置于10 ml 容量瓶中，并用80%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以80%乙醇作空白參照，在250 nm 處測定其吸光度。以濃度為自變量X，吸光度為因變量Y 繪制標準曲線，所得回歸方程為：Y=0.065 9X-0.005 6（R2=0.999 8）。結果表明，葛根素在0.0～11.9 μg/ml范圍內，線性關系良好。（2）精密度試驗：精密量取6號樣品溶液6 份，分別按（1）項下方法，于250 nm處測定吸光度，重復6 次，RSD 為0.22%，表明該法的精密度良好。（3）穩定性試驗：將6 號供試品溶液分別冷藏避光放置0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，按照（1）項下操作，測定吸光度。RSD 為1.28%，結果表明供試品溶液冷藏避光放置5 d 對測定結果無影響。（4）重復性試驗：取6 號供試品粉末1 g 共6 份，照“2.1.1”項下方法處理后，測定吸光度，RSD 為0.42%，表明該法重復性良好。（5）加樣回收率試驗：稱取6 號供試品粉末0.5 g 共6 份，每份精密加入相當于0.5 g 該供試品粉末中葛根素含量的對照品溶液，再按照“2.1.1”項下方法處理后，測定吸光度，計算平均回收率為99.96%，RSD 為0.89%。

2.1.5 總黃酮含量測定 將所得供試品溶液用80%乙醇溶液稀釋，其中根和莖供試品溶液稀釋100 倍，葉供試品溶液稀釋50 倍，花供試品溶液稀釋200 倍，搖勻，靜置10 min 后在250 nm 波長處測定吸光度。根據標準曲線，計算出總黃酮的百分含量后進行比較。總黃酮含量最高的為黎川縣所采集的野葛根，其次為資溪縣所采集的葛花，葛葉中總黃酮含量稍高于葛莖，地上莖葉黃酮含量較高的是橫峰縣贛葛2 號品種。見表2。

表2 葛不同部位總黃酮含量測定結果

2.2 葛地上部分總黃酮提取工藝參數優化

2.2.1 正交試驗設計 基于前期單因素試驗結果，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、回流提取時間（C）為主要考察因素，以葛地上部分（6 號樣品）中總黃酮提取率為考察指標，通過L9（34）正交試驗優化葛地上部分中總黃酮的最佳提取工藝參數。正交試驗因素水平表見表3。

表3 L9（34）正交試驗因素水平表

2.2.2 正交試驗結果 有表中極差R 值可知，影響葛地上部分總黃酮提取的因素主次順序為A＞B＞C，即提取所需乙醇濃度影響最大，其次為提取的料液比，最后為回流提取時間，葛地上部分總黃酮提取最佳組合工藝為A1B3C2，即提取乙醇濃度為60%、料液比為1:50、回流提取時間為1.5 h 時，葛地上部分莖中總黃酮提取量最高。見表4。

表4 葛地上部分總黃酮提取條件優化正交試驗結果

3 結論

葛根中主要的化學成分為葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷等異黃酮類化合物，文獻報道和前期研究表明，葛地上部分中含有與葛根類似的化學成分，關于其總黃酮測定的報道較多，主要有高效液相色譜法、紫外-可見分光光度法、熒光分光光度法等。紫外-可見分光光度法以NaNO2-Al（NO）3顯色法最為常用，通過對該法的專屬性考察，發現堿性環境、樣品成分復雜等因素均會影響實驗的準確性，具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質在510 nm 波長下也會有最大吸收，葛中異黃酮類化合物不具備鄰二酚羥基結構，我們前期預試亦證實采用NaNO2-Al（NO）3顯色法測定葛不同部位總黃酮的含量，對結果準確度干擾較大。本研究以葛根素為對照品，采用直接測定法在最大吸收波長250 nm 下測定了三種贛產葛不同部位的總黃酮含量，方法學考察符合含量測定要求，且相較于顯色法，操作更簡便和節省試劑。

近年來，關于葛地上部分的研究報道逐漸增多，本研究以中藥資源普查工作中所收集的2 種野葛和1 種粉葛作為研究對象，結果表明，總黃酮以黎川縣所采的野葛根含量最高，可達7.61%，地上部分莖和葉總黃酮含量則是橫峰縣所產的贛葛2 號較高。我們以葛莖為原料，采用正交設計對乙醇濃度、料液比和回流提取時間等提取工藝條件進行優化，得到最佳提取工藝為乙醇濃度60%、料液比1:50、回流1.5 h。K1（6.807）、K2（6.905）分別是提取時間為1 h、1.5 h的均值，極差R=0.098 亦表明提取時間對結果無顯著性影響，因此，為節省時間將提取時間改為回流提取1 h。

本研究比較了3 種贛產葛根及其地上部分總黃酮含量，但所收集的藥材品種數較少，不足以說明野葛與粉葛不同部位總黃酮含量的差異，但可初步揭示橫峰所產贛葛2 號地上部分黃酮類成分相對較高，也說明葛采收加工過程廢棄的地上部分具有潛在的利用價值。優化葛地上部分黃酮類成分的最佳提取工藝，可為葛資源的深入研究與開發利用提供理論基礎，延伸其資源經濟產業鏈，使葛資源利用進一步綜合化、合理化。