韭菜葉綠體的細胞生物學特征

張超越，楊艷鴻，薛雨欣，吳 敏，蓋立萍，李海剛，王守箐，劉 林

（臨沂大學藥學院，山東 臨沂 276005）

植物葉綠體白天進行光合作用，光合產物不 能及時運出時就轉化為淀粉，以作暫時貯藏，夜間淀粉降解，降解產物再以蔗糖形式轉運出葉肉細胞，進入維管束，裝載到韌皮部篩管，向植株其他生長部位運輸，因而白天積累淀粉是葉綠體的一個典型特征[1-5]。韭菜是栽培廣泛的葉類蔬菜作物，為了解韭菜葉的光合產物積累特征，本研究用組織化學和透射電子顯微技術對韭菜葉綠體進行了分析。

1 材料和方法

1.1 試驗地點

試驗于2017—2018年在臨沂大學藥用植物學實驗室進行。

1.2 試驗材料

供試韭菜品種為“壽光馬藺韭”，購于臨沂種子公司；供試西瓜品種為“京欣”，購于臨沂市種子公司。

1.3 試驗儀器及藥品

儀器：JEOL 1220電子顯微鏡，奧林巴斯光學顯微鏡，Ultracut R切片機。

藥品：Embed-812樹脂，固定劑為四氧化鋨，脂染色劑為戊二醛，電子染色劑為檸檬酸鉛和醋酸鈾。

1.4 試驗方法

以西瓜葉作為淀粉檢測對照，鑒定韭菜葉中的淀粉。韭菜于4月上旬育苗，6月下旬定植到大田，翌年5月取樣。西瓜于3月初播種于營養缽，4月移栽于大田。考慮到葉綠體白天進行光合作用、合成淀粉[2,4]，選擇晴朗天11：00取韭菜和西瓜植株新鮮幼葉和成熟葉進行淀粉鑒定和葉綠體超微特征分析。

1.4.1 淀粉組織化學鑒定方法

碘法[6]：樣品切成0.5 mm×0.5 mm小片，用2%戊二醛固定液（0.05 mol/L磷酸緩沖液配制，pH值 6.8）固定3 h，用1%四氧化鋨固定2 h，用碘-碘化鉀溶液染色2 h，然后脫水、樹脂包埋、切片，切片用苯胺藍復染，顯微鏡下如有淀粉則顯示藍色，同時也顯示出細胞結構。

錫夫試劑法[7]：樣品切成0.5 mm×0.5 mm小片，用2%戊二醛固定液固定3 h，用1%四氧化鋨固定2 h，洗滌后在0.5%高碘酸（0.3%硝酸配制）中浸1 h，自來水洗5 min，錫夫試劑中3 h，用偏亞硫酸氫鈉溶液洗滌3次，每次5 min，自來水洗20 min，然后脫水、樹脂包埋、切片，厚度1.0～1.5 μm，顯微鏡下觀察，如有淀粉存在則會呈現為紅色顆粒。切片經苯胺藍染色，則在顯示淀粉的同時也顯示細胞結構。

1.4.2 透射電子顯微技術

從大田韭菜和西瓜植株上分別剪下幼葉和成熟葉的部分葉片，浸入2%戊二醛固定液，回到實驗室內切去受損傷的邊緣，修成小于 1 mm×1 mm小塊，再放入2%戊二醛固定液，固定4 h。樣品用緩沖液洗滌3次，再用1%四氧化鋨溶液固定4 h。樣品用梯度酒精脫水，以丙酮置換酒精，包埋于Embed-812樹脂中。包埋塊用鉆石刀切片，切片厚度60 nm，用5%醋酸鈾染色20 min，再用0.1%檸檬酸鉛染色2 min，JEOL1220透射電子顯微鏡下觀察韭菜和西瓜葉肉細胞、表皮細胞和維管組織細胞中的葉綠體和淀粉。

2 結果與分析

2.1 淀粉鑒定結果

2.1.1 組織化學鑒定結果

如表1所示，用碘-碘化鉀和錫夫試劑檢測淀粉，韭菜幼葉和成熟葉都呈陰性反應，表明不含淀粉；經錫夫試劑和苯胺藍染色后，葉肉細胞葉綠體染色深且均勻（圖1 A），表明葉綠體內蛋白質豐富，但不含淀粉。同樣用碘-碘化鉀和錫夫試劑檢測，西瓜幼葉和成熟葉都呈陽性反應，顯示含有淀粉。用錫夫試劑和苯胺藍染色后，葉綠體著色不均勻，淀粉粒著色較深，葉綠體其他區域染色較淺（圖1 B）。

2.1.2 電子顯微鏡鑒定結果

電鏡下觀察，如表2所示，韭菜成熟葉和幼葉葉肉細胞中的葉綠體（圖1 C）、維管薄壁細胞中的質體（圖1 F）和表皮細胞中的質體（圖1 G）都沒有積累淀粉。與韭菜葉綠體形成鮮明對比，西瓜不僅幼葉和成熟葉葉肉細胞的葉綠體含有淀粉（圖1 H），而且維管薄壁細胞中的質體（圖1 I）和表皮細胞中的質體（圖1 J）也含有淀粉。

2.2 韭菜葉綠體的超微特征

韭菜葉綠體呈橢球形，大小約3 μm×5 μm，含大量類囊體，類囊體構成大量基粒，每個基粒都含有很多平行堆疊的類囊體（圖1 C—E）。在生長旺盛的幼葉片內，類囊體膜電子染色較淺，比基質著色能力弱，因此呈現負染色（圖1 C、D）；在成熟葉片內，類囊體膜染色較深，比基質著色能力強（圖1 E）。葉綠體含質體小球（質體內的脂滴），小球電子染色較淺。

表1 淀粉組織化學鑒定結果

表2 淀粉的電鏡觀察結果

維管薄壁細胞以輔助光合產物運輸和向韌皮部裝載為主要功能，這些細胞含有體積很小的質體，呈棒狀，大小約0.4 μm×1.2 μm，含少量類囊體，缺少典型基粒，顯然沒有分化成葉綠體（圖1 F），屬于原質體。以保護為功能的表皮細胞中的質體也很小，也呈棒狀，約為0.4 μm×1.2 μm，結構簡單，沒有分化成葉綠體，仍屬于原質體。

3 結論與討論

組織化學和電鏡技術研究結果表明，韭菜幼葉和成熟葉葉肉細胞中的葉綠體不含淀粉，以輔助光合產物運輸并向韌皮部篩管裝載為主要功能的維管薄壁細胞及以保護為功能的表皮細胞中未分化成葉綠體的質體也不積累淀粉。而用同樣方法檢測，西瓜幼葉和成熟葉不僅葉肉細胞中的葉綠體含有淀粉，維管組織和表皮中沒有分化成葉綠體的質體也含有淀粉。顯然，韭菜葉綠體沒有合成淀粉的能力，這是韭菜葉綠體的一個突出細胞生物學特征。此外，韭菜幼葉和成熟葉葉綠體的類囊體膜電子染色能力不同，幼葉類囊體膜電子染色深，成熟葉類囊體膜染色淺，這是韭菜葉綠體的另一個細胞生物學特征。

在韭菜葉中檢測不到淀粉，洋蔥和大蒜葉中也沒有檢測到淀粉[8]，因此不積累淀粉可能是蔥屬植物的一個共同特征，但這一推測尚需要對更多其他蔥屬植物進行研究。

韭菜葉表皮和維管薄壁細胞中的原質體不積累淀粉，一個有趣的問題是根冠細胞中的質體是否含有淀粉。根冠細胞中的淀粉體在根對重力信號感受過程中起重要作用，是維持根向地性所不可缺少的，根冠失去淀粉，根就失去向地性[9]。如果韭菜根冠細胞中不含淀粉，那么韭菜根感受重力的機制就與其他植物不同。

圖1 韭菜與西瓜葉片顯微與超微圖片

不同發育階段類囊體膜的著色能力有顯著差異，這是由膜蛋白的多少引起的，膜蛋白越多，膜的著色能力越強。在葉片旺盛生長階段，類囊體膜系統正處在快速建立階段，膜結合蛋白較少，因此膜著色能力較弱。而在成熟葉片內，類囊體膜上的光合系統業已建立，類囊體膜結合蛋白多，所以著色能力較強。膜蛋白主要是參與構成光合作用裝置的蛋白質，如光合電子傳遞鏈、ATP合酶等。因此，類囊體膜電子染色深意味著葉綠體光合作用能力較強，染色淺則意味著光合能力較弱。