熱休克蛋白65對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制研究*

李小余，王莎，董穎，馬旭東，王偉偉，韓江余，邵圣文

（湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)研究所，浙江 湖州 313000）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）在臨床上包括2 個(gè)獨(dú)立的疾病，即潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）和克羅恩病（Crohn's disease）[1]。目前關(guān)于IBD 的病因尚不很清楚，較為普遍的看法是遺傳易感性、免疫異常、腸道菌群共同參與IBD 發(fā)病。UC 發(fā)病在我國(guó)逐年呈上升趨勢(shì)[2-3]。有學(xué)者認(rèn)為，UC屬于自身免疫病范疇，患者自身免疫反應(yīng)異常是UC發(fā)病的重要因素[4]。UC 疾病具有易復(fù)發(fā)、易慢性化的特點(diǎn)，在臨床上易演變成慢性遷延性疾病，給臨床治療帶來(lái)困難。目前還沒(méi)有完全治愈UC 的藥物。關(guān)于UC 治療藥物和方法的研究一直為臨床所重視。有研究指出，熱休克蛋白（heat schock protein,HSP）家族成員之一的HSP65 蛋白具有免疫調(diào)節(jié)功能[5]。本研究探討HSP65 蛋白是否通過(guò)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells,Treg）對(duì)UC 小鼠產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，從而抑制小鼠腸道炎癥反應(yīng)，使得小鼠UC 疾病得以緩解，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

68 只C57BL/6 小鼠，雄性，8 周齡，體重18～20 g，合格證編號(hào)201703199，購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證SCXK（蘇）2016-0010]。PE 標(biāo)記的抗小鼠CD4 單抗（cat100407）、APC 標(biāo)記的抗小鼠FoxP3單抗（cat137221）、PE/Cy7 標(biāo)記的抗小鼠CD25 單抗（cat101915）、FITC 標(biāo)記的抗小鼠CD3 單抗（cat100305）為美國(guó)Biolegend 公司產(chǎn)品。HSP65 蛋白為本實(shí)驗(yàn)室自行制備。細(xì)胞流式分析采用美國(guó)BD 公司的FACS Canto流式細(xì)胞儀，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用FlowJo 軟件。

1.2 UC 小鼠模型復(fù)制

隨機(jī)選取62 只C57BL/6 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后開(kāi)始模型復(fù)制，每天給予3.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS，相對(duì)分子質(zhì)量36～50 kD）的滅菌水自由飲用，連續(xù)飲用7 d，第8 天起按無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)要求繼續(xù)飼養(yǎng)14 d，從存活小鼠中隨機(jī)取2 只處死，取結(jié)腸組織行病理檢查，結(jié)合小鼠UC 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index,DAI）評(píng)分，驗(yàn)證UC 小鼠模型復(fù)制成功。

1.3 HSP65 治療UC 小鼠

6 只健康小鼠設(shè)為正常對(duì)照組（A組）。48 只UC小鼠隨機(jī)分成4組（各12 只）：UC 模型對(duì)照組（B組）、低劑量組（C組）、中劑量組（D組）及高劑量組（E組）。A組和B組灌胃給予磷酸鹽緩沖液（PBS），C組、D組、E組小鼠分別灌胃給予HSP65 0.5、2.5 及 5.0 mg/kg。每隔1 天灌胃1 次，共7 次。灌胃期間，按SPF 要求常規(guī)飼養(yǎng)，末次灌胃后繼續(xù)飼養(yǎng)2 d。每天觀察記錄各組小鼠體重和大便性狀、便血情況，參照文獻(xiàn)計(jì)算DAI[6]。

1.4 小鼠檢測(cè)樣品取材

末次灌胃后飼養(yǎng)2 d，腹腔注射氯胺酮后，心臟取血處死小鼠。心臟穿刺取血后分離血清和血液有核細(xì)胞，分離小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，分別置于無(wú)菌平皿中，研碎后提取有核細(xì)胞；距回盲部約2 cm 處，取結(jié)腸中段組織2 塊，分別采用4%甲醛固定及-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HE 染色檢查及病理評(píng)分

結(jié)腸中段組織超薄切片后行HE 染色，光學(xué)顯微鏡檢查病理學(xué)變化情況，參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行結(jié)腸組織病理評(píng)分。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞

小鼠脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞分離：組織用無(wú)菌毛玻璃片研磨1～2 次，200 目濾網(wǎng)過(guò)濾，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液；加入1 ml 預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，冰上 裂解5 min，70 μm 孔徑細(xì)胞篩再次過(guò)濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml 待用。全血細(xì)胞處理：向抗凝血加入1 ml 預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解5 min，其余處理步驟同脾細(xì)胞處理方法，得到血液中的有核細(xì)胞。調(diào)節(jié)以上細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，在冰上加入PE 標(biāo)記的CD4 單抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的CD3單 抗，PE/Cy7 標(biāo)記的CD25 單抗，4 ℃避光孵育30 min；染色結(jié)束后，PBS 洗滌，4%多聚甲醛重懸細(xì)胞，4℃孵育20 min；0.1%皂素4℃孵育20 min，細(xì)胞破膜；PBS 洗滌2 次，加入APC 標(biāo)記的Foxp3 單抗，4℃孵育20 min，洗滌2 次，流式細(xì)胞儀收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：CD4+T 細(xì)胞數(shù)，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞數(shù)，計(jì)算Treg 細(xì)胞數(shù)占CD4+T 細(xì)胞數(shù)的比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0 軟件。計(jì)量資料以均 數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用Dunnett T3 法，獨(dú)立測(cè)量數(shù)據(jù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)

不同劑量HSP65 治療UC 小鼠的DAI 評(píng)分見(jiàn)表1，結(jié)果顯示：①不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠DAI 評(píng)分有差異（F= 374.465，P=0.000）；②各組小鼠DAI 評(píng)分有差異（F=57.057，P=0.000），HSP65 治療UC 小鼠14 d 后，D組和E組小鼠DAI 評(píng)分均低于B組小鼠（P＜0.05），E組小鼠DAI 評(píng)分低于D組（P＜0.05）；③HSP65 治療UC 小鼠14 d 后，各組小鼠DAI 評(píng)分變化趨勢(shì)有差異（F=64.895，P=0.000）。

表1 各組小鼠DAI 評(píng)分的比較（n =12，±s）

表1 各組小鼠DAI 評(píng)分的比較（n =12，±s）

組別 第1 天 第14 天B組 3.84±0.19 3.66±0.39 C組 3.87±0.18 3.07±0.15 D組 3.78±0.21 1.50±0.43 E組 3.82±0.31 0.83±0.31

2.2 小鼠結(jié)腸組織病理改變情況

A組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常；B組小鼠結(jié)腸組織黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，黏膜下和肌肉層大量細(xì)胞浸潤(rùn)；C組小鼠結(jié)腸組織黏膜結(jié)構(gòu)有中度損傷，黏膜下和肌肉層有中等程度細(xì)胞浸潤(rùn)；D 和E組，小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本正常，黏膜下和肌肉層有少量細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠結(jié)腸組織病理檢查結(jié)果（HE×100）

HSP65 治療UC 小鼠14 d 后，各組小鼠結(jié)腸病理評(píng)分有差異（F=68.641，P=0.000）；C、D 及E組小鼠 的結(jié)腸組織病理評(píng)分分別為（3.20±0.42）、（1.80± 0.79）及（1.10±0.57）分，均低于B組（3.70±0.48）分（P＜0.05）；E組小鼠的結(jié)腸組織病理評(píng)分低于C、D組（P＜0.05），D組小鼠結(jié)腸組織病理評(píng)分低于C組（P＜0.05）。

2.3 小鼠血液、脾臟、淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+表型的Treg 細(xì)胞比例

HSP65 治療14 d 后，各組小鼠的血液、脾臟以及腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+表型的Treg 細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。①各組小鼠血液Treg 細(xì)胞比例有差異（F=4.678，P=0.006），與A組比較，B、C、D、E組小鼠血液Treg 細(xì)胞比例均降低（P＜0.05）；②各組小鼠脾臟Treg 細(xì)胞比例有差異（F=5.786，P=0.002），與A組比較，B、C、D、E組小鼠脾臟Treg 細(xì)胞比例均降低（P＜0.05）；③各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Treg 細(xì)胞比例有差異（F=8.579，P=0.000），與A組比較，B、C組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Treg 細(xì)胞比例降低（P＜0.05），與B組比較，C、D、E組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Treg 細(xì)胞比例升高（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血液、脾臟、淋巴結(jié)中的Treg 細(xì)胞 比例比較（%，±s）

表2 各組小鼠血液、脾臟、淋巴結(jié)中的Treg 細(xì)胞 比例比較（%，±s）

注：①與A組比較，P ＜0.05；②與B組比較，P ＜0.05。

淋巴結(jié)Treg 比例A組 6 5.29±1.78 10.46±1.21 10.96±1.19 B組 12 3.06±0.81① 7.52±1.10① 6.29±1.41①C組 12 3.15±0.97① 8.13±1.05① 9.12±0.97①②D組 12 3.32±0.74① 8.65±0.91① 9.79±1.52②E組 12 3.20±0.65① 8.83±1.30① 10.07±2.10②組別 n 血液Treg 比例脾臟Treg 比例

3 討論

HSP 家族蛋白廣泛存在于真核及原核生物細(xì)胞中。一般而言，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，HSP 家族蛋白啟動(dòng)表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞之功能。HSP 家族蛋白成員眾多，包括HSP60、HSP70、HSP90 等家族蛋白。HSP60 家族蛋白成員包括哺乳動(dòng)物來(lái)源的HSP60 蛋白和結(jié)核桿菌HSP65 蛋白，兩者高度同源，能夠發(fā)生交叉免疫反應(yīng)[8]。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在UC 患者結(jié)腸黏膜組織內(nèi)，包括HSP60、HSP10、HSP70、HSP90 蛋白在內(nèi)的多種HSP 家族蛋白異常增多，這些異常增多的HSP 家族蛋白通過(guò)分子模擬機(jī)制激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)結(jié)腸黏膜組織的異常自身免疫應(yīng)答，造成結(jié)腸黏膜組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，患者則出現(xiàn)相應(yīng)的UC 臨床癥狀[9-10]。

已有研究表明，口服HSP60 蛋白或HSP65 蛋白，可以緩解自身免疫性疾病[5]。有學(xué)者報(bào)道，對(duì)ApoE基因敲除小鼠，通過(guò)高脂飲食飼養(yǎng)復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型，實(shí)驗(yàn)組小鼠在高脂飲食同時(shí)口服給與HSP60 蛋白，實(shí)驗(yàn)組小鼠大動(dòng)脈根部的粥樣斑塊大小比模型組減小，實(shí)驗(yàn)組小鼠血漿IL-10 比模型組增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠血漿Ⅱ型干擾素（IFN-γ）比模型組減少，表明口服HSP60 蛋白可以使小鼠動(dòng)脈內(nèi)的粥樣斑塊減小，同時(shí)可以抑制小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[11]。本研究結(jié)果證實(shí)，HSP65 蛋白可以改善UC 小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)，使UC 小鼠病變的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。本研究還觀察到，HSP65 蛋白對(duì)UC 小鼠的治療效應(yīng)跟HSP65 蛋白之間存在劑量依賴性。考慮到治療成本和依從性，筆者建議治療方案為：HSP65 蛋白以2.5 mg/kg體重的劑量灌胃UC 小鼠，1 次/d，間隔1 d，連續(xù)7 次。

Treg 細(xì)胞屬于CD4+T 細(xì)胞亞群，主要通過(guò)抑制效應(yīng)T 細(xì)胞的免疫活性而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用，在維持免疫耐受、抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)和免疫病理方面有重要作用[12-13]。Treg 細(xì)胞包括2 種表型，即靜止Treg 細(xì)胞和活化Treg 細(xì)胞。核轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白（forkhead box p3,Foxp3）是活化Tregs 細(xì)胞的特異性標(biāo)志[13]。當(dāng)靜止Treg 細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)Foxp3，細(xì)胞轉(zhuǎn)變成活化Treg細(xì)胞，細(xì)胞表型也由靜止Treg 細(xì)胞（CD4+CD25+表型）轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨疶reg 細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+表型）。活化Treg 細(xì)胞能夠分泌抑制性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞的功能，進(jìn)而阻止或減輕炎癥反應(yīng)[13]。

本研究顯示，UC 小鼠給予HSP65 蛋白后，小鼠血液和脾臟組織中的活化Treg 細(xì)胞比例未發(fā)生改變，但是小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的活化Treg 細(xì)胞比例增加。由此，筆者認(rèn)為，HSP65 蛋白是通過(guò)誘導(dǎo)UC 小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的活化Treg 細(xì)胞比例增加來(lái)實(shí)現(xiàn)。接下來(lái)的問(wèn)題是：UC 小鼠給予HSP65 后，腸系膜淋巴結(jié)中增多的活化Treg 細(xì)胞來(lái)源是哪里？由于小鼠血液和脾臟組織中的活化Treg 細(xì)胞比例未發(fā)生明顯改變，這就排除腸系膜淋巴結(jié)中增多的活化Treg 細(xì)胞是從血液和脾臟組織遷移而來(lái)的可能。那么，腸系膜淋巴結(jié)中增多的活化Treg 細(xì)胞很可能是由腸系膜淋巴結(jié)中的靜止Treg 細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。

總之，采用灌胃方式給予HSP65 蛋白可以緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，其中可能的機(jī)制是：HSP65 蛋白通過(guò)激活小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的靜止Treg 細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)變成活化Treg 細(xì)胞，進(jìn)而增加小鼠腸系膜淋巴結(jié)中的活化Treg 細(xì)胞比例，隨后通過(guò)活化Treg 細(xì)胞分泌抑制性細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抑制腸道炎癥反應(yīng)作用。