東方蜜蜂大肚病致病菌的分離鑒定及乳酸菌對其抑菌效果

汪思凡 曹振輝 潘洪彬

摘要：蜜蜂大肚病會引起蜂群的大面積死亡，造成巨大損失，通過無菌操作采集患大肚病的東方蜜蜂成年工蜂腸道，LB培養基分離培養致病菌，采用形態分析、生理生化檢測、16S rDNA基因序列分析和人工攻毒試驗對致病菌進行鑒定;應用濾紙片擴散法檢測致病菌耐藥性;采用瓊脂孔擴散法研究從健康東方蜜蜂成年工蜂腸道中自主分離的瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌對致病菌的抑制作用。結果顯示，從患大肚病的東方蜜蜂成年工蜂腸道中共分離得到12株菌株，均為革蘭氏陰性桿菌，根據形態、生理生化和16S rDNA序列分析結果鑒定12株菌株均為黃桿菌;12株黃桿菌對氨芐青霉素、鏈霉素、萬古霉素、卡那霉素、慶大霉素、新生霉素耐藥，對阿莫西林敏感;飼喂黃桿菌KMD1和LPD2的東方蜜蜂成年工蜂腹部有明顯膨脹，在飼喂6 d后對照組蜜蜂死亡率為25%，飼喂黃桿菌KMD1組蜜蜂死亡率為81%，飼喂黃桿菌LPD2組蜜蜂死亡率為73%;瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌均能顯著抑制黃桿菌KMD1和LPD2增殖。鑒定出東方蜜蜂大肚病的致病菌為黃桿菌，東方蜜蜂腸道源乳酸菌對黃桿菌具有顯著抑菌效果，試驗結果對采用微生物制劑防治東方蜜蜂大肚病奠定了理論基礎。

關鍵詞：東方蜜蜂;致病菌;黃桿菌;耐藥性;乳桿菌

中圖分類號： S895 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0189-04

蜜蜂是一種常見的有益昆蟲，屬于膜翅目細腰亞目針尾部蜜蜂總科蜜蜂科昆蟲的統稱，作為一種高度社會性昆蟲，其傳染性疾病產生會呈現爆發性發生和混合性發生的特點，一旦發病會表現出流行速度快、發病區域廣、致病率高的特點，對蜂群威脅極大[1]。

蜜蜂大肚子病是一種傳染性極強的蜜蜂疾病，在幾周內可蔓延到全群，患病嚴重的蜂群，死蜂會堆積滿整個箱底。該病不分時節均可發生，由于受到外界惡劣環境的影響，蜜蜂不能出巢，無法排泄飛翔，導致其后腸積糞膨脹，加上粉蜜源斷絕，僅靠人工飼養，營養往往不足，抵抗力減弱，則會易患此病，患病蜜蜂往往行動呆滯，對外界刺激反應遲鈍，較嚴重者會完全喪失飛行能力，在麻痹中死亡。該病在蜂群中發生不僅嚴重影響了整個蜂群的健康，還對蜂群的研究造成了巨大的損失[2]，因此該研究主要針對引起蜜蜂大肚子病的病原菌進行分離鑒定，以期為該病診斷、預防和治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2017年5月分別從云南農業大學養蜂場（云南昆明）與羅平養蜂場（云南羅平）隨機各取12只東方蜜蜂成年工蜂，通過無菌操作分別取出其腸道。

1.1.2 乳酸菌菌株 瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和羅伊氏乳桿菌（L. reuteri），由筆者所在課題組從健康東方蜜蜂腸道內自主分離，GenBank登錄號為MG574870和MG574871。

1.1.3 主要試劑 LB培養基，革蘭氏染色劑，葡萄糖、鼠李糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露醇、甘露糖，藥敏試紙，購于英國Oxoid公司;DNA快速抽提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;Taq DNA聚合酶，購自上海Promega生物產品有限公司;DL2000 DNA marker，購自TaKaRa公司;溶菌酶，購自Sigama公司;16S rDNA引物，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 東方蜜蜂大肚病致病菌的分離 在無菌條件下取出蜜蜂腸道，轉移入1.5 mL離心管中，勻漿后接入LB液體培養基中37 ℃培養箱培養，富集后將培養液梯度稀釋接種于LB瓊脂培養基上，37 ℃培養后從平板中挑取每個樣品中菌落形態不同的單菌落，純化3次后于-80 ℃冰箱凍存備用[3]。

1.2.2 東方蜜蜂大肚病致病菌的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定 將分離所得菌株分別通過革蘭氏染色試驗、接觸酶測定試驗、葡萄糖產酸產氣試驗、糖發酵試驗、硫化氫試驗、硝酸銀試驗[4]對分離所得菌株進行鑒定。

1.2.2.2 分子生物學鑒定 按照生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速抽提試劑盒（SK8225）說明書對菌株進行基因DNA的提取，以提取DNA為模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增，PCR擴增體系為：2×Ex Taq buffer 25 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O2 1 μL，共50 μL體系;PCR擴增條件為：95 ℃ 預變性4 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環;72 ℃最后延伸 10 min，4 ℃保存。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗，檢驗擴增成功的產物進行測序，測定序列后分析比對并通過ClustalX 2.0和Mega 4.0軟件構建系統發育樹對分離所得菌株進行鑒定。

1.2.3 抗生素敏感性試驗 采用濾紙片擴散法，取分離株菌懸液0.5 mL加入10 mL溫度約50 ℃的LB固體培養基中迅速混勻，倒入已鋪底的平皿中，待培養基凝固后，貼放標準藥敏紙片，測量抑菌圈直徑[5]。試驗用抗生素的種類、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標準見表1。

1.2.4 人工感染試驗

1.2.4.1 生長曲線的建立 將黃桿菌接種至LB肉湯培養基中，37 ℃培養，活化3次，用肉湯培養基稀釋菌液至D600 nm值在0.2～0.8之間，在紫外分光光度計上測量D600 nm，以稀釋后D600 nm值在0.2～0.8之間的菌液進行梯度稀釋，稀釋后的菌液均勻地加到瓊脂平板上，37 ℃培養后計數。

1.2.4.2 攻毒 從云南農業大學養蜂場捉取300只東方蜜蜂成年工蜂，平均分為3組，分別飼養在3個自制培養箱中，試驗Ⅰ組為對照組，飼喂普通無菌糖水，試驗Ⅱ組和Ⅲ組分別飼喂添加有108 CFU/mL黃桿菌的糖水，試驗過程均保證充足糖、水的供應[6]。

1.2.5 乳酸菌對黃桿菌的體外抑制作用 瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌37 ℃厭氧過夜培養，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min）收集上清液，調節pH值至6.2備用。采用瓊脂打孔擴散法，將黃桿菌37 ℃過夜培養后，吸取0.02 mL菌液于 20 mL 溫度50 ℃的TSA中劇烈混合后傾注平板，將中和的乳酸菌培養上清液加入80 mm瓊脂孔內，37 ℃培養24 h后，測量抑菌圈直徑（mm），并與參考菌株鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）GG比較[7]。

2 結果與分析

2.1 東方蜜蜂大肚病致病菌的分離

在無菌條件下取出蜜蜂腸道，轉移入1.5 mL離心管中，勻漿后接入LB培養基中，通過純化培養共分離得到12株分離菌，（編號為KMD1、KMD2、KMD3、KMD4、KMD5、KMD6、KMD7、KMD8、KMD9、LPD1、LPD2、LPD3），分離純化后的菌落形態及菌體形態的觀察情況見表2。

2.2 東方蜜蜂大肚病致病菌的分離

2.2.1 生理生化鑒定 將分離得到的12株分離菌進行革蘭氏染色、接觸酶、葡萄糖產酸產氣、糖類發酵、硫化氫、硝酸銀的生理生化試驗，由表3、表4可知，對照《伯杰氏細菌手冊》，篩選分離出的12株菌生理生化特性符合黃桿菌的特征。

2.2.2 分子生物學鑒定

2.2.2.1 16S rDNA序列的同源性分析 將測序得到12株分離菌的16S rDNA序列利用NCBI的BLAST進行同源性比對，12株分離菌株的比對結果顯示為黃桿菌（表5）。

2.2.2.2 系統發育分析 從NCBI的Genbank核酸數據庫中隨機取已收錄的黃桿菌16S rDNA序列，運用Mage 5.0和ClustalX 1.83構建系統發育樹，由圖1可知，所有分離菌與黃桿菌屬中的F. frigidimaris親緣性最近，結合 16S rDNA 序列同源性分析結果，表明從患大肚病的東方蜜蜂的腸道中分離得到的12株分離菌均為黃桿菌。

2.2.3 人工攻毒試驗

2.2.3.1 生長曲線的建立 選擇KMD1、LPD2 2株黃桿菌對成年東方工蜂進行攻毒試驗，分別建立KMD1、LPD2 2株黃桿菌的生長曲線，由圖2、圖3可知，黃桿菌KMD1的D值（y）與菌落數（x）的線性關系為y=（21.969x+1.015 1）×108，r2為 0.990 1;黃桿菌LPD2的D值（y）與菌落數（x）的線性關系為y=（13.092x+1.755 7）×108，r2為0.991 8。

2.2.3.2 蜜蜂死亡率 飼喂KMD1組為試驗Ⅱ組，飼喂LPD2組為試驗Ⅲ組，由圖4可知，飼喂6 d后試驗Ⅱ組和Ⅲ組相較對照組死亡率均顯著上升（P<0.05），對照組蜜蜂死亡率為25%，試驗Ⅱ組蜜蜂死亡率為81%，試驗Ⅲ組蜜蜂死亡率為73%。與對照組比較，黃桿菌攻毒組蜜蜂腹部有明顯膨脹、行動遲緩，多在箱底爬行，使用小鑷子擠壓蜜蜂尾部，會排出糞便，嗅其味臭。

2.3 抗生素敏感性試驗

對12株黃桿菌采用濾紙片擴散法[5]進行抗生素敏感試驗，抗生素敏感性的判定參照WHO提供的CLSI最新版的標準進行。由表6可知，12株黃桿菌對氨芐青霉素、鏈霉素、萬古霉素、卡那霉素、慶大霉素、新生霉素基本耐藥，對阿莫西林敏感。

2.4 乳酸菌對黃桿菌的體外抑制作用

由表7可知，東方蜜蜂腸道源乳酸菌瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的培養上清液對12株黃桿菌具有顯著抑制作用，抑菌活性優于或與參考菌株LGG相當。

3 討論與結論

本研究從東方蜜蜂成年工蜂腸道中分離出了蜜蜂大肚病的致病菌，通過生理生化分析、分子生物學鑒定和攻毒試驗，鑒定其為黃桿菌科黃桿菌屬菌株。抗生素敏感性試驗測定了致病菌對各種抗生素的敏感程度，確定了12株黃桿菌對氨芐青霉素、鏈霉素、萬古霉素、卡那霉素、慶大霉素、新生霉素基本耐藥，對阿莫西林敏感。因此，在治療蜜蜂大肚病的過程中，可以適量使用阿莫西林。Decostere等報道，從熱帶魚中分離出的柱狀黃桿菌對新生霉素耐藥[8]，與本試驗結果較一致。但陳昌福等報道，從湖北各地分離的柱狀黃桿菌對大多數供試抗生素均高度敏感[9];黃文芳等亦報道其分離的柱狀黃桿對多種抗生素、呋喃類敏感，共27種藥物僅對磺胺噻唑不敏感，皆與本研究結果差異較大[10]。分析結果可能由于不同宿主、不同地域、不同分離菌株間的藥物耐藥性具有一定的差異，亦可能是由于抗生素濫用致使細菌具有了耐藥機制，亦或是長期使用小劑量抗生素，不僅未達到殺菌目的，反而逐步誘發了細菌的耐藥性。因此，在規模化蜜蜂養殖過程中，對于治療蜜蜂疾病，一定要做到查明病因，科學化、合理化地使用抗生素，同時在藥物的使用上也須做到聯合使用、交叉使用的方法，不僅可以充分發揮藥物的療效，也可以避免細菌長期與一種藥物接觸，產生耐藥機制[11]。

乳酸菌作為一種益生菌其在抑制腸道致病菌的方面已有了廣泛研究，乳酸菌能產生有機酸、過氧化氫和細菌素，具有抑菌作用，且其還可以通過與致病菌競爭腸上皮細胞黏附位點，達到抑制致病菌的作用[12]。本研究采用從健康東方蜜蜂腸道內分離出的2株乳酸菌（瑞士乳桿菌和羅伊氏乳桿菌），首次研究了其對蜜蜂大肚病致病菌黃桿菌的抑制作用，結果顯示這2株乳酸菌均具有顯著抗菌活性，為采用微生物制劑防治蜜蜂疾病、降低抗生素依賴性提供了理論依據。

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