氧化型低密度脂蛋白與急性冠狀動脈綜合征患者CD4+T細胞Notch1、Notch2表達的相關性研究

朱家平，朱李茹

（襄陽市中心醫(yī)院，湖北文理學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗部，襄陽 441021）

冠心病是指由于冠狀動脈粥樣硬化使血管腔狹窄甚至堵塞，導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，在中醫(yī)學中屬于“胸痹”“心痛”“真心痛”等范疇[1]。中醫(yī)學對冠心病的治療積累了豐富的臨床經驗。目前益氣養(yǎng)陰、活血化瘀治療冠心病的療效已被包括西醫(yī)在內的醫(yī)學界所確認。目前，中藥在臨床上的應用越來越廣泛，其中茶色素治療冠心病患者能夠抑制體內低密度脂蛋白的氧化，降低了患者血漿中氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的水平[2]。近期研究發(fā)現，冠心病患者或動物模型均出現輔助性T細胞（Th）的異常活化，主要是促炎的Th1升高及抗炎的Th2降低，然而出現這種現象的機制尚未闡明[3-5]。ox-LDL是冠心病發(fā)生的主要風險因素，ox-LDL在血管內膜上的堆積會誘導內皮細胞炎性反應，導致其分泌炎性因子和趨化因子，進一步引起炎癥因子釋放和免疫激活[6-7]。有研究報道，ox-LDL可誘導Th1細胞分化[8]，而Notch信號傳導介導T細胞的分化過程[9]。因此，筆者探討了ox-LDL與急性冠狀動脈綜合征（ACS）患者CD4+T細胞Notch1、Notch2表達的相關性。

1 資料及方法

1.1 主要試劑 人源ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限公司，批號：SY0441）；APC標記小鼠抗人Notch1、PE標記小鼠抗人Notch2單抗（Sigma公司）；白細胞介素 4（IL-4）-PE、干擾素 γ（TNF-γ）-PE（Sigma公司）；人源ox-LDL ELISA試劑盒（武漢華美生物有限公司，批號：ab14526-65）。

1.2 研究對象 收集2016年3月—2017年10月本院確診的冠心病患者88例，男49例，女39例，平均年齡為（53.64±11.43）歲，其中[ACS患者56例，急性心肌梗死（AMI）患者26例，不穩(wěn)定型心絞痛（UA）患者 30例]，穩(wěn)定型心絞痛（SA）患者 32例，另外納入同期健康體檢者30例，男17例，女13例，平均年齡為（54.64±12.63）歲。患者組與對照組之間年齡和性別無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。同時排除出現感染性疾病、癌癥、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、近期服用非甾體抗炎藥或免疫抑制劑的人群。并且每位納入對象均簽署知情同意書。

1.3 血漿ox-LDL水平分析 將血漿標本放置室溫平衡，按照ELISA試劑盒說明書進行試驗。

1.4 流式細胞術分選CD4+T細胞 采用葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周單個核細胞[10]。將分離的外周血單個核細胞培養(yǎng)5 h，棄去貼壁細胞，便得到淋巴細胞。調整細胞密度為1×107，加入Percp/cy 5.5標記小鼠抗人CD3、FITC標記小鼠抗人CD4抗體，室溫避光孵育0.5 h，PBS清洗2遍，重懸后流式細胞儀分選CD4+T細胞。并采用流式細胞術對Th1、Th2細胞進行計數。

1.5 流式細胞術檢測CD4+T細胞Notch表達 從健康人群中分離得到CD4+T細胞接種于6孔板，隨機將細胞分為4組，及對照組、低、中、高劑量ox-LDL 組（40、80、160 mg/L），每組設置 3個復孔。共孵育72 h后，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗2遍，每組細胞再分為兩組，分別加入濃度為0.2 g/L的APC標記小鼠抗人Notch1、PE標記小鼠抗人Notch2單抗，室溫避光反應0.5 h，PBS清洗后離心、重懸，進行流式細胞術檢測Notch1、Notch2表達。

1.6 數據分析 計量資料采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，計數資料采用構成比表示，組間比較采用卡方檢驗，相關性采用Pearson分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組一般臨床資料比較 4組研究對象在年齡、性別、高血壓、糖尿病、吸煙及HDL-C水平等方面均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與對照組相比，UA組和AMI組患者TC、TG及LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），而SA組與對照組相比無統(tǒng)計學差異，UA組與AMI組相比也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組CD4+T細胞Notch1和Notch2表達、Th1/Th2比值及ox-LDL水平 UA組、AMI組CD4+T細胞Notch1、Notch2表達相對于對照組顯著降低（P＜0.05），而Th1/Th2比值及ox-LDL水平相對于對照組顯著升高（P＜0.05）。CD4+T細胞Notch1和Notch2表達、Th1/Th2比值及ox-LDL水平在SA組和對照組之間相比無明顯差異，UA組與AMI組相比也無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表2。經Pearson相關性分析發(fā)現，ACS患者（UA組、AMI組）外周血ox-LDL與Notch1（r=-0.653，P＜0.01）、Notch2（r=-0.468，P＜0.01）表達呈明顯負相關，與Th1/Th2比值呈明顯正相關（r=0.582，P<0.01）。見圖 1。

表1 各組患者一般臨床資料Tab.1 General clinical data of patients of each group

表2 各組CD4+T細胞Notch1和Notch2表達、Th1/Th2比值及 ox-LDL水平（x±s）Tab.2 Expression of Notch1，Notch2 in CD4+T cells，Th1/Th2 ratio and levels of ox-LDL in each group（x±s）

2.3 ox-LDL對ACS患者CD4+T細胞Notch表達的影響 采用ox-LDL刺激流式分選的人外周血CD4+細胞72 h，對照組、低、中、高劑量ox-LDL組中Notch1 表達分別為（1.05±0.25）%、（0.84±0.23）%、（0.62±0.17）%及（0.31±0.14）%，與對照組相比，低、中、高劑量ox-LDL組均顯著降低（P＜0.05）。除此之外，對照組、低、中、高劑量ox-LDL組中 Notch2表達分別為（8.26±1.43）%、（5.34±1.30）%、（3.27±0.85）%及（1.39±0.64）%，與對照組相比，低、中、高劑量ox-LDL組均顯著降低（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

圖1 各指標相關性分析Fig.1 Correlation analyses of each indicator

圖2 ox-LDL對CD4+T細胞Notch表達的影響（x±s）Fig.2 Effects of ox-LDL on the expression of Notch in CD4+cells（x±s）

冠心病屬于多因素的大動脈炎性病變，而炎癥反應和免疫應答起著關鍵性作用。CD4+T細胞依據分泌的細胞因子和功能不同分為Th1和Th2亞群，Th1主要生理作用是誘導細胞免疫和免疫調節(jié)。Th2的主要生理作用是促使體液免疫和免疫調節(jié)，并且Th1/Th2比例失衡會誘導自身免疫性疾病的發(fā)生[11]。本研究用白細胞介素 4（IL-4）-PE、干擾素 γ（TNF-γ）-PE分別作為Th1和Th2細胞的標志，結果提示ACS患者Th1/Th2比值相對于對照組顯著升高。說明ACS患者存在Th1/Th2比例失衡，機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)受到破壞，這可能與ACS患者細胞免疫功能紊亂和細胞介導的免疫病理過程相關。

ox-LDL是導致冠心病發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，由于ox-LDL的過度表達會導致內皮細胞、巨噬細胞及CD4+T淋巴細胞凋亡的發(fā)生[12]。ox-LDL在引起動脈粥硬化過程中，會導致斑塊不穩(wěn)定，提出冠心病患者血漿中ox-LDL水平的升高，代表著ACS的出現，并且ox-LDL水平與ACS病情有著密切聯(lián)系。本研究發(fā)現ACS患者ox-LDL水平相對于健康對照組顯著升高，早期研究表明ox-LDL能明顯誘導巨噬細胞Notch1受體的表達，提示Notch信號通路參與冠心病的發(fā)生[13]。ox-LDL作用機制主要通過TLR2/4受體活化巨噬細胞，誘導Notch配體Jagged1上調，產生大量促炎因子。研究發(fā)現UA組、SA組CD4+T細胞Notch1、Notch2表達相對于健康對照組顯著降低；相關性分析發(fā)現ACS患者外周血ox-LDL與Notch1、Notch2表達呈明顯負相關，與Th1/Th2比值呈明顯正相關。

接著在體外研究了ox-LDL刺激對分離出的CD4+T細胞Notch1、Notch2表達的影響，結果表明低、中、高劑量的ox-LDL均能明顯抑制Notch1、Notch2的表達。動物實驗發(fā)現，Notch2信號可誘導Th2的分化，Notch1/Notch2信號通路可誘導GATA-3和IL-4的上調來促使Th2的分化，而不是作用于IL-4/STAT6信號通路[14]。早期研究也發(fā)現中藥參參康心能誘導Notch信號通路活化，進而對冠心病氣虛血疲證小鼠具有保護作用[15]。由此可推測，參參康心可能是通過促使Notch信號傳導，誘導輔助性T細胞向抗炎的Th2細胞分化，機體起著免疫調節(jié)作用，進而緩解了冠心病氣虛血疲證小鼠的癥狀。綜上所述，ox-LD可抑制Notch1/Notch2的表達來降低Th2的分化，并且Th2與Th1在體內相互作用，抑制Th2分化，便是促使Th1的分化。總之，ox-LDL能明顯抑制人外周血CD4+T細胞Notch1、Notch2分子表達，可能與ox-LDL抑制Th2分化而促進Th1異常分化有關，參與冠心病的發(fā)生發(fā)展。