腎疏寧干預HBV誘導的HK-2細胞轉分化及遷徙能力的研究*

楊熙凱，徐 冰，王耀光

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300381；2.天津中醫藥大學，天津 301617）

乙型肝炎病毒相關性腎炎（HBV-GN），簡稱乙肝相關性腎炎，中國是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高發地區，HBV-GN的檢出率呈逐年上升趨勢[1]。目前多認為HBV-GN的發病為HBV直接侵犯腎臟上皮細胞[2]導致，同時腎臟中確定了HBV抗原的表達，并揭示了病毒復制和直接病毒誘導的病理改變[3-4]。當乙肝病毒侵犯腎臟時，會對腎小管上皮細胞造成損傷導致腎小管-間質纖維化的發生[5]，腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化（TEMT）是腎間質纖維化的關鍵過程。腎疏寧是黃文政教授“疏利少陽”學術思想的代表方劑，用于治療免疫球蛋白A（IgA）腎病[6]、膜增生性腎炎[7]、HBV-GN[8]等腎病，是臨床常用方劑，但是本方在治療HBV-GN的作用機制方面尚不清楚。故本實驗使用脂質體轉染C基因型重組乙型肝炎病毒（pHY106-HBV）質粒至腎小管上皮細胞，旨在證明HBV質粒可以誘導HK-2細胞發生轉分化，而腎疏寧含藥血清可以抑制其對HK-2細胞的不良作用。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與試劑 SANYO MCO-15AC CO2恒溫培養箱，SANYO公司；DMED/F12培養基（批號：C11995500BT），Gibco公司；胎牛血清（批號：35-010-CV），Cellgro 公司；Opti-MEM（批號：31985-070），Gibco 公司；lipofectamine 2000（批號：11668019），Invitrogen公司；人乙肝病毒e抗原（HBeAg）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）Kit ELISA（EK0215），SAB 公司；人乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）ELISA Kit（EK0216），SAB 公司；Transwell小室（PI342050），Corning公司。

1.2 實驗藥物 腎疏寧的方劑組成為柴胡15 g，生黃芪 30 g，黃芩 10 g，丹參 30 g，鬼箭羽 30 g，山茱萸12 g，萹蓄15 g，白花蛇舌草30 g，益母草30 g。中藥購自天津中醫藥大學第一附屬醫院，煎煮后使用旋轉蒸發儀濃縮至生藥含量為5.512 g/mL。pHY106-HBV及pHY106真核表達載體（不含重組HBV的空載質粒），為北京地壇醫院劉順愛教授惠贈。

1.3 細胞與小鼠 HK-2細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；SPF級成年C57BL/6小鼠60只，體質量20～25 g，雌雄各半，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所。

2 實驗方法

2.1 制備含藥血清 將小鼠隨機分為空白組、腎疏寧低濃度組、腎疏寧中濃度組、腎疏寧高濃度組，每組15只。根據人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表換算，腎疏寧高濃度組生藥濃度為2.756 g/mL，腎疏寧中濃度組生藥濃度為2.034 g/mL，腎疏寧低濃度組生藥濃度為1.313 g/mL，以每日每只小鼠0.2 mL/10 g灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水，灌胃7 d。末次灌胃前8 h禁食、不禁水，灌胃2 h后予以摘眼球采血，靜置后3 000 r/min 4℃離心20 min，取上清，56 ℃水浴箱滅活 30 min，0.22 μm 濾膜過濾除菌，-80℃保存。

2.2 細胞傳代 HK-2細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養于37℃、5%CO2的細胞培養箱中。每隔2 d換新鮮培養基1次，培養融合至80%以上，使用胰酶消化，消化后傳代培養。實驗前，無血清培養基饑餓培養24 h同步細胞，重復實驗3次。

2.3 實驗分組 收集細胞均勻接種于6孔培養板中，培養24 h后分為6組，分別為：1）空白血清對照組：HK-2細胞用DMEM/F12培養基培養，予10%生理鹽水組血清培養。2）空質粒組：將空質粒（pHY106）轉染至HK-2細胞，予10%生理鹽水組血清培養。3）HBV組：轉染HBV質粒（pHY106-HBV）的HK-2細胞，予以10%生理鹽水含藥血清培養。4）腎疏寧低濃度組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，予10%腎疏寧低濃度組含藥血清培養。5）腎疏寧中濃度組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，予10%腎疏寧中濃度組含藥血清培養。6）腎疏寧高濃度組：轉染HBV質粒的HK-2細胞，予10%腎疏寧高濃度含藥血清培養。含藥血清干預48 h后進行檢測。

2.4 質粒轉染 觀察6孔板中細胞，當達到60%～70%密度時，進行瞬時轉染。將2 μg質粒和5 μL Lipofectamine 2000分別加入250 μL Opti-MEM 培養基中，并輕輕混合。室溫下靜置5 min，將兩者混合，室溫靜置20 min。吸取原有培基，將1.5 mL新鮮DMEM/F12培養基加入每孔。空白血清對照組另加500 μL DMEM/F12 培養基; 將 500 μL lipofectamine 2000-空質粒（pHY106）復合物加入空質粒組。將500μLlipofectamine 2000-HBV質粒（pHY106-HBV）加入HBV組及腎疏寧含藥血清組，注意轉染時不可加入血清。6 h后換液并分別加入各組對應的含藥血清繼續培養。

2.5 ELISA法檢測HBsAg、HBeAg的表達 按試劑盒說明采用ELISA法檢測各組細胞裂解液中HBsAg、HBeAg的含量。

2.6 免疫細胞化學法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 將細胞用4%多聚甲醛固定，并在室溫下用0.3%TritonX-100處理20 min。與3%H2O2溫育后，在室溫下用兔血清封閉細胞30 min。然后分別加入第一抗體 α-SMA（abcam，1∶200 稀釋）、E-cadherin（abcam，1∶50 稀釋），在4℃下孵育細胞過夜。使用生物素標記的第二抗體在37℃下孵育1 h。在8 min DAB孵育后，用蘇木精對細胞進行反染色，隨后進行梯度醇脫水，二甲苯透明和樹膠密封。每組3個獨立樣本，每個樣本隨機取3個視野進行拍照。采用生物醫學圖像分析系統（Image pro plus）進行圖像分析，用平均吸光度表示陽性物質的相對含量。

2.7 Transwell法檢測細胞遷徙能力 將Transwell放置于24孔板中并標號，消化細胞，種植于Transwell上室。同時取等量細胞在24孔板中培養作為細胞總量的參考。在下室加入10%胎牛血清（FBS）的培養基以形成營養梯度。培養箱中培養48 h后，去除培養基，用4%的多聚甲醛4℃過夜后取出風干，同時去除24孔板中固定的參照細胞的多聚甲醛并風干。用0.01%的結晶紫染色30 min。清洗后拍照并檢測吸光度。

2.8 統計方法 應用SPSS 21.0軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，若數據方差不齊，進行Welch’s anova檢驗，兩兩比較采用Games-Howell法進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 HBsAg、HBeAg的表達 空質粒組與空白血清組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；HBV組與空質粒組和空白血清組比較，HBsAg、HBeAg表達上調，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

3.2 α-SMA、E-cadherin的表達

3.2.1 α-SMA蛋白的表達結果 α-SMA蛋白為上皮細胞表型轉化為間充質細胞的標記蛋白，免疫細胞化學法檢測α-SMA蛋白，結果如表2，圖1所示，空質粒組與空白血清組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與空質粒組比較，HBV組α-SMA蛋白表達明顯上調（P＜0.01）；與HBV組比較，腎疏寧低濃度組、腎疏寧中濃度組、腎疏寧高濃度組α-SMA蛋白表達明顯下調（P＜0.01）。HBV組胞質呈棕黃色，而各治療組胞質棕黃色顆粒表現為不同程度的減少；腎疏寧各干預組組間比較，與腎疏寧高濃度組比較，腎疏寧低濃度組α-SMA蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；腎疏寧中濃度組 α-SMA蛋白表達相對較多（P＜0.01）。

表 1 HBsAg、HBeAg 的表達（x±s）Tab.1 Expression of HBsAg，HBeAg（x±s）

表2 各組細胞α-SMA、E-cadherin蛋白表達結果（x±s）Tab.2 Expression of α-SMA and E-cadherin proteins of cells in each group（x±s）

圖1 各組α-SMA表達結果（標尺：19 μm）Fig.1 Expression of α-SMA in each group（scale bar：19 μm）

3.2.2 E-cadherin蛋白的表達結果 E-cadherin蛋白為腎小管上皮細胞間黏性連接蛋白，空質粒組與空白血清組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與空質粒組比較，HBV組E-cadherin蛋白表達下調（P＜0.01）；與HBV組比較，各治療組有上調E-cadherin蛋白表達的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。HBV組細胞胞漿內棕黃色顆粒減少，E-cadherin蛋白表達降低，其余治療組較HBV組，其胞漿內棕黃色顆粒均略有增多，但增多不明顯。見圖2。

表3 各組細胞遷徙能力（x±s）Tab.3 Migration capacity of cells in each group（x±s）

圖2 各組E-cadherin表達結果（標尺：19 μm）Fig.2 Expression of E-cadherin in each group（scale bar：19 μm）

3.3 Transwell法檢測細胞遷徙能力 應用Transwell法動態觀察EMT過程中細胞遷徙能力的變化，以及各治療藥物對細胞遷徙能力的抑制作用。如圖3可見，空質粒組與空白血清組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；HBV組與空質粒組比較，因HBV誘導HK-2細胞發生轉分化發生EMT，細胞遷徙能力明顯增強（P＜0.01）。與HBV組比較，腎疏寧低濃度組、腎疏寧中濃度組、腎疏寧高濃度組細胞遷徙能力明顯減弱（P＜0.01）。腎疏寧各干預組組間比較細胞遷徙能力無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 Transwell法檢測各組細胞遷徙能力（標尺：25 μm）Fig.3 Migration capacity of cells detected by Transwell in each group（scale bar：25 μm）

4 討論

中國乙型病毒性肝炎的發病人數占全球感染乙肝病毒總人數的30%[9]。HBV抗原在腎小管上皮細胞持續表達會介導免疫炎癥反應，使腎小管上皮細胞發生表型轉化，并向間質纖維化方向發展。

中醫并無HBV-GN的病名，根據患者的臨床癥狀和疾病的特點，可歸于中醫“尿濁”“尿血”“虛勞”“鼓脹”等范疇。黃文政教授在治療腎病時，使用“三焦網絡學說”作為理論指導，療效甚佳。在治療HBV-GN時，黃文政教授認為面對HBV-GN水腫、蛋白尿等癥狀，使用疏利少陽、通暢三焦的方法，調節三焦網絡系統，恢復水液正常代謝。同時黃文政教授也認為HBV-GN存在濕熱邪毒內蘊臟腑、病情纏綿累及脾腎的病機。所謂毒邪，即濕熱、濁毒等，對于西醫學而言，則為HBV侵犯人體后的有毒代謝產物、血肌酐、尿素氮等。法當解毒利濕，肝腎虧虛則應當補益脾腎，所以使用黃教授“疏利三焦”學術思想的代表方腎疏寧治療本病，此方由柴胡、生黃芪、黃芩、丹參、鬼箭羽、山茱萸、萹蓄、白花蛇舌草、益母草組成。方中柴胡疏解少陽樞機，黃芩清解三焦郁火；黃芪補氣、山茱萸養陰；白花蛇舌草、萹蓄清熱利濕解毒；丹參、鬼箭羽、益母草活血化瘀通絡，諸藥搭配，疏利少陽，扶正祛邪。

本研究中采用的重組質粒是以中國感染患者的HBV為模板構建，拷貝的C基因型HBV的（含HBV的全基因組）pHY106-HBV，并且C基因型是中國HBV感染患者的多見基因型，具有代表性，它能在細胞內高效復制。當使用HBV質粒轉染HK-2細胞時，通過ELISA檢測，可以發現HBV有效的復制和表達了相應的抗原，并且通過免疫細胞化學法，也可以發現α-SMA、E-cadherin的變化，此過程中，上皮標志蛋白E-cadherin表達下調，細胞失去上皮細胞特性，細胞之間黏附能力的下降[10]，而腎小管上皮細胞通過發生上皮間質轉化（EMT）而轉化為成纖維細胞/肌成纖維細胞，其中肌成纖維細胞的標記蛋白α-SMA蛋白表達逐漸增多。同時應用Transwell法觀察發現，HBV轉染增強了在HK-2細胞的遷徙能力，這無疑是上皮細胞表型以及細胞的骨架蛋白的改變，才導致了細胞遷移能力的增強。綜上，HBV轉染對HK-2細胞的表型轉化確有影響。

而當使用腎疏寧藥物干預后筆者發現，腎疏寧各濃度含藥血清α-SMA蛋白的表達有明顯的抑制作用，并且腎疏寧中濃度組有較好效果。遺憾的是3組藥物對E-cadherin蛋白的表達雖然有一定的上調趨勢，但并沒有統計學意義。由此可知，腎疏寧在干預HBV-GN腎小管上皮細胞表型轉化中是以抑制α-SMA為方向，達到減輕腎小管上皮細胞表型轉化的目的。已有研究表明，柴胡、生黃芪等藥物可抑制α-SMA[11-12]，這些研究從單味藥層面對中藥的作用進行了闡述，間接證明了腎疏寧的有效性。同時，腎疏寧，雖然對E-cadherin蛋白的作用不明顯，但其可以下調細胞的遷徙能力，這可能與中藥復方的多靶點作用有關，比如基質金屬蛋白酶（MMP）家族對于細胞的遷徙能力就具有重要作用[13]，這也為研究者進一步研究腎疏寧的作用提供了新的方向。故本研究提示，HBV轉染HK-2細胞會導致細胞轉分化并增強細胞遷徙能力，而腎疏寧含藥血清可以減輕由HBV導致的上皮細胞轉分化并減弱其細胞遷徙能力，但其具體的機制有待進一步研究。