基于HPLC-UV特征圖譜與主成分分析的蔓荊子配方顆粒的質(zhì)量控制研究*

張永苗 ，張 兵 ，梁春霞 ，彭 輝 ，王仁興 ，薛志峰 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津 301617）

蔓荊子為馬鞭草科牡荊屬多年生落葉小灌木單葉蔓荊（Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.）或蔓荊（Vitex trifolia L.）的干燥成熟果實(shí)[1]，主產(chǎn)于山東、廣西、廣東、福建、江西、浙江等地。蔓荊子在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，謂“荊實(shí)，味苦，微寒，主筋骨間寒熱，濕痹據(jù)攣，明目堅(jiān)齒，利九竅，去白蟲，久服輕身耐老”[2]。蔓荊子中主要含有酚類、木脂素類、黃酮類、萜類等化學(xué)成分[3-9]。現(xiàn)代研究表明，蔓荊子具有鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、祛痰、抗腫瘤、抗衰老和改善微循環(huán)的藥理作用[10-13]，常用于疏散風(fēng)熱、清理頭目、止痛的功效。蔓荊子中主要含有原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素3種活性成分，其中原兒茶酸具有抗菌[14]、抗炎[15]、抗氧化[16]、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛[17]、保護(hù)缺血和缺氧神經(jīng)元細(xì)胞[18-19]等作用，對羥基苯甲酸具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用[20]，蔓荊子黃素具有抗炎[21-24]、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤[24-30]、免疫調(diào)節(jié)[18]的作用，它們是蔓荊子發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

相比傳統(tǒng)湯劑，中藥配方顆粒具有方便服用、高效、易攜帶和安全可控等優(yōu)點(diǎn)。本文在參照古法的基礎(chǔ)上，采用生品粉碎后進(jìn)行水提、過濾濃縮、干燥制粒，可充分提取蔓荊子的有效成分，提高其配方顆粒的質(zhì)量。蔓荊子配方顆粒在性味歸經(jīng)，功能主治方面與蔓荊子藥材一致。本文通過測定不同產(chǎn)地批次蔓荊子的配方顆粒中原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素進(jìn)行含量和指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析方法對其指紋圖譜特征變量進(jìn)行降維處理，尋求其在化學(xué)成分方面的共性與差異，根據(jù)相似相聚原理，區(qū)分優(yōu)劣，為蔓荊子配方顆粒的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

安捷倫1260LC-VWD液相色譜儀（美國安捷倫公司）；安捷倫1260LC-DAD液相色譜儀（美國安捷倫公司）；B-290型噴霧干燥儀（瑞士Buchi公司）；GL2-25干法制粒機(jī)（張家港開創(chuàng)機(jī)械制造有限公司）；FA124型萬分之一天平（天津億諾科學(xué)儀器有限公司）；XP205十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

對羥基苯甲酸對照品（批號2169，含量以99.2%計(jì)）、原兒茶酸對照品（批號5668，含量以100%計(jì)）、蔓荊子黃素對照品（批號5185，含量以99.6%計(jì)）均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。糊精（西安天正藥業(yè)有限公司），乙腈、甲醇、磷酸、甲酸均為色譜純（購自Fisher Scientific公司），水為超純水。10批蔓荊子藥材均由黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司提供，編號分別為A1～A10，來源見表1。按2015年版《中國藥典》一部蔓荊子鑒別項(xiàng)下方法檢驗(yàn)，鑒定為品為馬鞭草科植物單葉蔓荊（Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.）或蔓荊（Vitex trifolia L.）的干燥成熟果實(shí)。按其含量測定項(xiàng)下測定蔓荊子黃素的含量，結(jié)果顯示，蔓荊子藥材中蔓荊子黃素含量均大于0.030%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表1 蔓荊子產(chǎn)地及批號Tab.1 Producing places and batches of Viticis Fructus

2 方法與結(jié)果

2.1 蔓荊子配方顆粒含量測定方法的建立與測定

2.1.1 對照品儲備液的配制 取原兒茶酸15.26 mg、對羥基苯甲酸11.82 mg、蔓荊子黃素對照品10.46 mg，精密稱定，分別置于50、25和50 mL量瓶中，加60%甲醇分別制成每1 mL含原兒茶酸0.305 2 mg、對羥基苯甲酸0.469 0 mg、蔓荊子黃素0.208 4 mg的對照品儲備液。

2.1.2 混標(biāo)溶液的配制 分別精密吸取上述各對照品儲備液2、5和2 mL適量于50 mL量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含原兒茶酸12.21 μg、對羥基苯甲酸 46.90 μg、蔓荊子黃素 8.335 μg的混合對照品溶液①。分別精密吸取上述各對照品儲備液10、25和10 mL于100 mL量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL 含原兒茶酸 30.52 μg、對羥基苯甲酸 117.3 μg、蔓荊子黃素20.84 μg的混合對照品溶液②。

2.1.3 配方顆粒的制備 取A1～A10蔓荊子藥材粉碎成粗粉，加12倍水，回流提取2 h，趁熱濾過，減壓濃縮湯劑密度至1.020 g/cm3，按藥（干膏量）與糊精1∶1比例加入，混合均勻后，噴霧干燥，以干燥粉末進(jìn)行干法制粒（每克配方顆粒相當(dāng)于5 g蔓荊子飲片），所得10批顆粒依次編號記為S1～S10。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取蔓荊子配方顆粒粉末0.3 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 60%甲醇，密封，稱質(zhì)量，超聲處理45 min（功率400 W，頻率40 kHz），放冷，再次稱質(zhì)量，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，靜置后取上清液，以0.22 μm孔徑的濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.5 色譜條件 Agilent ZOBRAX Plus C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為 0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～3 min（93%A），3～13 min（93%-90%A），13～25 min（90%-83%A），25～35 min（83%-74%A），35～40 min（74%-60%A），40～45 min（60%-40%A），45～55 min（40%-10%A），流速1.0 mL/min，柱溫 35 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，程序性檢測波長，0～9 min（254 nm），9～9.01 min（254～258 nm），9.01～20 min（258 nm），20～20.01min（258～260 nm），20.01～55 min（260 nm）。理論塔板數(shù)按對羥基苯甲酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.1.6 專屬性考察 取混合對照品溶液①和江西SQ80703的蔓荊子配方顆粒（S8）制備的供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件分析。由圖1可知，原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素混合對照品溶液、蔓荊子配方顆粒供試品溶液在相同的保留時間都有色譜峰，同時無溶劑峰干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性考察圖譜Fig.1 HPLC chromatograms exclusive investigation

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品原兒茶酸10.12 mg、對羥基苯甲酸25.42 mg、蔓荊子黃素10.26 mg，置于100 mL量瓶，加60%甲醇溶解，得每1 mL含原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素分別為 0.101 2 mg、0.252 2 mg、0.102 2 mg 的混合對照品儲備液。將混合對照品儲備溶液分別進(jìn)行2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍稀釋，得系列濃度溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以溶液濃度為（μg/mL）橫坐標(biāo)、其峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，得原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的線性回歸方程分別為 Y=37.208X-2.269 1（r2=0.999 9）、Y=60.517X-6.483 0（r2=0.999 9）和 Y=30.455X-1.644 8（r2=0.999 9）。表明原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素分別在 1.012～50.60 μg/mL、2.522～126.1 μg/mL和1.022～51.09 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.8 精密度考察 取混合對照品溶液①，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素峰面積的RSD分別為0.25%、0.27%和0.23%，表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性考察 精密吸取S8的供試品溶液10 μL，分別在 0、2、4、6、8、10、12、24、48 和 72 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣室溫度與室溫一致，測定對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素的峰面積，計(jì)算對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素峰面積的RSD分別為0.22%、0.28%和0.39%，表明供試品溶液在室溫條件下72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性考察 精密稱取S8的蔓荊子配方顆粒粉末6份，按“2.1.4”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果蔓荊子配方顆粒中原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的平均含量分別為0.102 5%、0.390 1%和0.070 38%，RSD分別為0.64%、0.63%和0.72%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率考察 精密稱取S8的蔓荊子配方顆粒粉末0.15 g，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密加入混合對照品溶液②5 mL，平行制備6份，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件測定。計(jì)算原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的回收率分別為99.56%、100.7%和104.3%，RSD分別為0.65%、0.47%和0.68%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。見表2。

2.1.12 樣品含量測定 取S1～S10的蔓荊子配方顆粒，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算10批蔓荊子配方顆粒中對羥基苯甲酸、原兒茶酸和蔓荊子黃素的含量。各批次蔓荊子配方顆粒中的原兒茶酸含量范圍在0.070 77%～0.142 0%之間、對羥基苯甲酸含量在0.257 6%～0.719 3%之間、蔓荊子黃素含量在0.016 57%～0.143 0%之間。10批蔓荊子顆粒中的原兒茶酸含量相差2.0倍，對羥基苯甲酸含量相差2.8倍，蔓荊子黃素含量相差8.6倍，說明不同產(chǎn)地批次的蔓荊子所制備的配方顆粒有效成分含量差異大。見表3。

表2 原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素的加樣回收率實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)Tab.2 Relevant data of recovery test for protocatechuic acid，parahydroxybenzoic acid and viticin

其中江西產(chǎn)地的蔓荊子所制備的蔓荊子配方顆粒（S7～S10）3種主要活性成分含量均較高，明顯優(yōu)于原藥材為安徽的配方顆粒（S1～S3）和原藥材為廣西的配方顆粒（S4～S6）。根據(jù)《中國藥典》2015版對蔓荊子藥材進(jìn)行質(zhì)量檢查，其中江西產(chǎn)地的蔓荊子藥材質(zhì)量優(yōu)于安徽和廣西等地藥材，結(jié)果如表1所示。藥材質(zhì)量檢查結(jié)果與顆粒劑含量測定結(jié)果一致，表明使用江西產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)藥材所制備的配方顆粒質(zhì)量也較優(yōu)。

2.2 蔓荊子配方顆粒指紋圖譜的建立與測定

2.2.1 指紋圖譜的建立 取S8蔓荊子配方顆粒，按照“2.1.4”項(xiàng)下方法制作供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，確定了其中10個峰面積較大的特征峰，其中峰2、峰3、峰10分別是原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素。見圖2。原兒茶酸是蔓荊子藥材及其配方顆粒中的主要有效成分之一，各個批次的蔓荊子藥材所制備的蔓荊子配方顆粒中均含有此峰，峰面積占總峰面積適宜，無其他干擾峰，因此確定原兒茶酸作為指紋圖譜參照峰。

表3 原兒茶酸、對羥基苯甲酸、蔓荊子黃素的含量測定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of protocatechuic acid，parahydroxybenzoic acid and viticin

圖2 蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜Fig.2 Fingerprint chromatogram of Viticis Fructus formula granules

2.2.2 專屬性考察 取混合對照品溶液①和S8蔓荊子配方顆粒制備的供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件分析?；旌蠈φ掌啡芤?、供試品溶液在相同的保留時間都有色譜峰，并無溶劑峰干擾，專屬性良好，如圖1所示。

2.2.3 精密度考察 取S8蔓荊子配方顆粒制備的供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，得指紋圖譜。計(jì)算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.078%～0.14%之間，相對峰面積的RSD在0.15%～1.1%之間，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 取S8蔓荊子配方顆粒制備的供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、10、12、24、48、72 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣室溫度與室溫一致，測得指紋圖譜，計(jì)算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.14%～1.1%之間，相對峰面積的RSD在0.53%～5.8%之間，表明樣品溶液在室溫條件下72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性考察 取S8蔓荊子配方顆粒按“2.1.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算得供試品溶液中各共有峰相對保留時間的RSD在0.032%～0.13%之間，相對峰面積的RSD在0.21%～0.75%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 指紋圖譜相似度評價 取S1～S10的蔓荊子配方顆粒，按“2.1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，建立10批蔓荊子配方顆粒（S1～S10）的指紋圖譜疊加圖，見圖3。得到蔓荊子配方顆粒對照指紋圖譜（R），每批樣品與R比較，計(jì)算10批顆粒劑指紋圖譜相似度，S1～S10樣品相似度結(jié)果分別是0.975，0.984，0.993，0.992，0.914，0.996，0.992，0.976，0.976，0.978。10批蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜相似度差異不大，表明其化學(xué)成分含量總體穩(wěn)定。

2.7 主成分分析 主成分分析是考察多個變量間相關(guān)性的一種多元降維統(tǒng)計(jì)方法，通過研究少數(shù)幾個主成分來揭示多個變量間的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，描述最大的變異量，能夠有效研究樣本組分上的差別[31]。中藥指紋圖譜可較全面地表征中藥中的多種化學(xué)成分，指紋圖譜結(jié)合主成分分析可評價藥物之間的相似性和差異性，是適合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制方法[32-35]。

主成分分析方法對蔓荊子配方顆粒指紋圖譜中的10個特征峰進(jìn)行分析，特征峰信息見圖3，以2號峰（原兒茶酸）為參照峰，得到各特征峰的相對峰面積，見表4。采用SIMCA 14.0軟件，以各特征峰的相對峰面積為變量，對10批蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜特征峰進(jìn)行主成分分析。選取3個主成分建立分析模型，結(jié)果累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)82.4%，能代表特征峰的信息。分別利用3個主成分（PC1，PC2，PC3）進(jìn)行區(qū)分，將變量投影在二維空間上，擬合分析生成10批蔓荊子配方顆粒的主成分分析得分圖和載荷圖，分別用來觀察蔓荊子配方顆粒所用藥材的產(chǎn)區(qū)分布狀況和分析各個特征峰對產(chǎn)地區(qū)分所起的貢獻(xiàn)作用。

圖3 蔓荊子配方顆粒的指紋圖譜疊加圖和對照指紋圖譜RFig.3 Fingerprints overlay and contrast fingerprint R of Viticis Fructus formula granules

表4 10批蔓荊子配方顆粒高效液相色譜（HPLC）特征峰的相對峰面積Tab.4 Relative peak areas of HPLC characteristic peaks of 10 batches of Viticis Fructus formula granules

主成分分析的得分圖見圖4，根據(jù)相似相聚原理，明顯分為2類，江西產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒（S7～S10）樣品聚為一類，安徽和廣西產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒（S1～S6）聚為一類。廣西產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒（S4～S6）分散比較集中，安徽產(chǎn)地蔓荊子的配方顆粒（S1～S3）同產(chǎn)區(qū)的差異相對較大。根據(jù)10批蔓荊子顆粒劑含量測定結(jié)果可知，江西的蔓荊子藥材質(zhì)量較優(yōu)，用該產(chǎn)地蔓荊子藥材制備配方顆粒，測得顆粒中3種活性成分含量均較高，指紋圖譜相似度較高，主成分分析方法通過對指紋圖譜特征峰進(jìn)行分析，將江西產(chǎn)地的蔓荊子制備的顆粒劑聚在一起，表明江西產(chǎn)地蔓荊子的顆粒劑化學(xué)成分含量穩(wěn)定，質(zhì)量均一性良好，故可判斷出江西產(chǎn)地蔓荊子藥材制備的配方顆粒較其安徽和廣西產(chǎn)地的優(yōu)質(zhì)。

圖4 10批蔓荊子配方顆粒HPLC特征峰主成分分析得分圖Fig.4 Score plot of HPLC characteristic peaks of 10 batches of Viticis Fructus formula granules

主成分分析載荷圖見圖5，距離載荷圖原點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量，其絕對值越大，對分類模型總體方差貢獻(xiàn)程度越高，代表該特征峰對產(chǎn)地分布所起的作用越大。由圖可知，所選的特征峰峰均對分類模型有較高的貢獻(xiàn)度，貢獻(xiàn)度最大的3個峰分別為峰3（對羥基苯甲酸）、峰5、峰10（蔓荊子黃素），鑒于峰5化合物成分尚不明確，且在蔓荊子藥材及配方顆粒中含量相對較低，難以準(zhǔn)確定性定量，而峰3、峰10為蔓荊子藥材及配方顆粒的主要活性成分，含量較高，對分類模型貢獻(xiàn)度最大。本研究選擇的10個共有峰具有明顯的特征性，可作為該模型的特征變量。

圖5 10批蔓荊子配方顆粒HPLC特征峰主成分分析載荷圖Fig.5 Loading plot of HPLC characteristic peaks of 10 batches of Viticis Fructus formula granules

3 討論

通過3D全波長（190～400 nm）掃描，得原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素最大吸收波長分別為260 nm、254 nm和258 nm，故采用程序性波長對含量測定和指紋圖譜進(jìn)行準(zhǔn)確、便捷、高效的研究。

蔓荊子配方顆粒既保留了原藥材的功用，又能安全、有效、便捷、質(zhì)量可控地應(yīng)用于臨床。根據(jù)蔓荊子炮制的文獻(xiàn)考證，蔓荊子在唐代及以前以生用破碎為主，宋代以后又增加炒制、酒浸的炮制方法[36]，如今蔓荊子的生品和微炒后的炮制品應(yīng)用較多，炒制雖會提高蔓荊子總黃酮含量[7，37]，但其鎮(zhèn)痛效果明顯下降[38]。本實(shí)驗(yàn)以水為提取溶劑，采用粉碎蔓荊子藥材的方式來提高其有效成分的提取效率。

鑒于中藥湯劑中含有較多的糖類和鞣質(zhì)成分，濕法制粒難度大，為防止顆粒劑花?，F(xiàn)象，故采用內(nèi)加輔料法噴霧干燥、干法制粒。甘露醇、蔗糖、乳糖、糊精和淀粉均是常用的稀釋劑，乳糖易溶于水，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無吸濕性，但乳糖含糖量較高，不適合高血壓、齲齒等患者的長時間服用。甘露醇溶解效果好，內(nèi)加輔料得率低，損失大，成型率、外觀效果均較差。淀粉的溶解效果較差，影響顆粒的溶解度，而糊精的溶解性比淀粉好，綜合考慮，最終確定糊精作為制備蔓荊子配方顆粒的輔料。

原兒茶酸、對羥基苯甲酸和蔓荊子黃素作為蔓荊子配方顆粒的主要活性成分，定量分析這3種主要活性成分是保證蔓荊子配方顆粒安全、有效應(yīng)用的前提。根據(jù)顆粒劑中單個化學(xué)成分的高低來難以判斷藥物質(zhì)量，指紋圖譜能較全面的反映蔓荊子配方顆粒的化學(xué)成分及其相對比例，鑒于個體樣本本身的差異，可通過選擇圖譜中特征峰對其進(jìn)行整體性評價。鑒于中藥材的產(chǎn)地對藥物的質(zhì)量和療效有影響[39-40]，本文以不同產(chǎn)地蔓荊子藥材制備的配方顆粒為例，基于HPLC-UV法的含量測定結(jié)合指紋圖譜分析與主成分分析的評價方法，在一定程度上表征了10批蔓荊子配方顆粒在化學(xué)成分方面的共性與差異，可區(qū)分出由江西產(chǎn)地的蔓荊子所制備的配方顆粒質(zhì)量最佳，均一性良好，基于三者的綜合信息，可以為蔓荊子配方顆粒甄選原藥材、質(zhì)量控制和評價提供相應(yīng)的依據(jù)。