基于網絡藥理學莪術抗陰道炎的機制研究△

黃志瓊 劉 麗 楊 潔 陳晶晶 林文靜 溫高靜 呂杰強

(溫州醫科大學溫州市第三臨床學院(溫州市人民醫院) 溫州 325000)

陰道炎是指由不同致病菌引起的各種陰道黏膜炎性疾病的總稱，是最常見的女性生殖系統感染性疾病。由于該病會反復發作，且在女性的各個年齡階段都較容易發生，往往影響著大多數婦女的生活質量，造成很多困擾。目前西醫治療陰道炎多以抗菌藥物為主，但許多控制炎癥的殺菌藥品會使患者出現不良反應。中醫治療陰道炎秉著“治外必本諸內”的原則，將內服與外治、整體與局部相結合進行論治，有較好的療效。

莪術始載于《藥性論》，是姜科植物蓬莪術、溫郁金和廣西莪術的干燥根莖。研究表明，莪術具有抗腫瘤、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用[1]。由于中藥具有多成分、多途徑、多靶點協同作用的特點，因此從單一的角度并不能全面地闡釋莪術的藥理作用。

隨著系統生物學的出現，網絡藥理學是在組學數據分析、網絡數據庫檢索及計算機虛擬計算的基礎上，系統地探索藥物藥效及作用機制的一種研究方法，網絡藥理學的研究思路注重系統性和整體性，這與中醫藥整體觀相一致，被用來探索中藥的分子作用機制。本研究從網絡藥理學的角度預測莪術抗陰道炎的作用靶點和信號通路，進一步分析其抗陰道炎的作用機制。

1 方法

1.1 莪術小分子化合物信息的獲取

從TCMSP數據庫(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)中獲取，按照 OB (Oral bioavailability) ≥30%、DL (Drug-likeness) ≥0.12 的篩選條件，共篩選出具有良好口服利用度和類藥性的候選化合物11個。

1.2 莪術活性組分的靶標篩選

應用TCMSP數據庫查詢莪術活性組分對應的靶蛋白，以Uniprot (https://www.uniprot.org/)數據庫查詢靶蛋白對應的基因簡稱。UniProt 是一個集中收錄蛋白質資源并能與其他資源相互聯系的數據庫，也是目前為止收錄蛋白質序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個數據庫。

1.3 陰道炎相關靶點的篩選

從GeneCards (The Human Gene Database)[2]和人類孟德爾遺傳綜合數據庫(online mendelian inheritance in man,OMIM)[3]數據庫篩選陰道炎的相關疾病靶點，以“vaginitis”為關鍵詞進行檢索，獲取、篩選并建立陰道炎相關靶點數據集。

1.4 莪術活性組分與陰道炎共有靶標基因的獲取

將類OB ≥30%、DL≥0.12的莪術活性組分對應的靶標基因與陰道炎對應的靶標基因取交集，獲得莪術活性組分抗陰道炎的靶標基因。

1.5 蛋白-蛋白相互作用分析(Protein-Protein Interaction, PPI)

將交集得到的基因應用STRING[4]數據庫構建蛋白相互作用網絡，得到莪術抗陰道炎的體內反應網絡。

1.6 “陰道炎-基因-靶標-莪術”網絡的構建及分析

闡明莪術活性組分與陰道炎靶點之間的關系，將莪術活性組分、活性組分對應的靶點、陰道炎的靶標和交互蛋白靶點構建“陰道炎-基因-靶標-莪術”網絡，將莪術化合物抗陰道炎的化合物-靶點信息導入Cytoscape[5]軟件進行可視化分析,并分析各靶點的相關拓撲參數。

1.7 基因富集分析

采用Cytoscape的Cluego分析工具對相互作用基因進行了GO分子功能分析、GO生物學過程分析和KEGG ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes)[6]靶點通路富集分析，進一步說明中藥化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

2 結果

2.1 莪術小分子化合物和相應靶標的虛擬篩選

按照閾值設定 OB (Oral bioavailability) ≥30%、DL (Drug-likeness) ≥0.12，共篩選出具有良好口服利用度和類藥性的候選化合物12個(表1)，通過TCMSP共檢索出73個靶蛋白，并通過Uniprot數據庫將預測出的靶點蛋白名轉換為基因名，去除重復的基因名后共獲取27個靶基因。

表1 莪術活性組分的篩選

Mol IDMolecule nameOB %DLMOL000296hederagenin36.910.75MOL000474(-)-Epoxycaryophyllene35.940.13MOL000889isocurcumenol97.670.13MOL000891(1R,10R)-epoxy-1,10-dihydrocurdione36.730.12MOL000897(3S,3aR,8aR)-3,8a-dihydroxy-5-isopropylidene-3,8-dimethyl-1,2,3a,4-tetrahydroazulen-6-one38.70.12MOL000901BRN 309458587.820.13MOL000902curcumol103.550.13MOL000903Gweicurculactone42.920.14MOL000906wenjine47.930.27MOL000915(1S,10S),(4S,5S)-germacrone-1(10),4-diepoxide30.480.18MOL000940bisdemethoxycurcumin77.380.26MOL000296hederagenin36.910.75

2.2 陰道炎靶標檢索

通過GeneCards和OMIM數據庫檢索與陰道炎相關的基因，共檢索出1569個基因。

2.3 莪術活性組分與陰道炎共有靶標基因的獲取

將莪術活性成分對應的27個靶基因和陰道炎1569靶基因進行匯集，生成14個兩者共同作用的基因，見表2。

表2 莪術活性組分與陰道炎共有靶標基因

靶蛋白基因Progesterone receptorPGRNuclear receptor coactivator 2NCOA2Muscarinic acetylcholine receptor M3CHRM3Prostaglandin G/H synthase 1PTGS1Sodium channel protein type 5 subunit alphaSCN5AProstaglandin G/H synthase 2PTGS2Retinoic acid receptor RXR-alphaRXRAAcetylcholinesteraseACHECathepsin DCTSDTrypsin-1PRSS1Glucocorticoid receptorNR3C1Estrogen receptorESR1Androgen receptorARMineralocorticoid receptorNR3C2

2.4 莪術抗陰道炎的體內反應網絡

將莪術和陰道炎共同作用的14個靶標基因通過STRING 數據庫構建“蛋白-蛋白”互作網絡(圖1)，該網絡包含14個節點，平均節點度為3.57，平均局部聚類系數為0.628。

2.5 “陰道炎-基因-靶標-莪術”網絡的構建

為了更清晰直觀地闡釋術抗陰道炎的復雜網絡關系，運用Cytoscape3.7.1構建“陰道炎-基因-靶標-莪術”網絡圖并進行可視化(圖2)，綠色長方形節點代表莪術關鍵活性成分，黃色圓形節點代表莪術與陰道炎交互的基因。該網絡包含21個節點和86條邊，體現了中藥的多成分、多靶點相互作用的復雜網絡關系，驗證了莪術對治療陰道炎是通過多途徑、多環節、多靶標，整體協同的方式發揮作用的。

圖1 莪術作用于陰道炎的蛋白互作網絡

2.6 基因富集分析

為了闡明莪術治療陰道炎作用的分子機制，利用采用Cytoscape 3.7.1的Cluego分析工具對相互作用基因進行了GO分子功能分析、GO生物學過程分析和KEGG靶點通路富集分析。

2.6.1莪術治療陰道炎的GO基因分子功能分析

富集分析得到3條P≤0.05的分子功能分類，依次是類固醇激素受體、轉錄因子活性/配體調控特異性序列DNA結合、核受體活性。

2.6.2莪術治療陰道炎的GO生物學過程分析

富集分析得到9條P≤0.05的生物學過程分析，排名前5位的生物學過程依次是女性妊娠的母體過程、妊娠的乳腺分支導管、前列腺上皮形態形成、分支導管參與乳腺導管形態發生、前列腺形態發生。

2.6.3莪術治療陰道炎的潛在靶點KEGG 通路富集分析

利用Perl和R語言編程，對篩選出的基因進行KEGG 通路富集分析，得到2條信號通路，分別為雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路，表明莪術的有效成分可以作用于這些信號通路達到治療陰道炎的目的。

圖2 “陰道炎-基因-靶標-莪術”相互作用網絡

3 討論

陰道炎作為一種婦科疾病，臨床癥狀主要見于陰道分泌物增多、陰道疼痛、白帶增多等癥狀，從而使得女性身體健康受到嚴重威脅[7]。目前西醫治療多以抗生素為主，但易產生耐藥性，且可能會引起菌群失調而致經久不愈的陰道炎。因此，尋求療效好而副作用小的治療陰道炎的方法及藥物成為十分重要的研究課題。網絡藥理學為莪術抗陰道炎的作用機制提供潛在的藥理學探討基礎，篩選出莪術中活性化合物，獲取其作用靶點，映射得到其抗陰道炎的潛在靶點，建立“陰道炎-基因-靶標-莪術”網絡圖，從而有效驗證及預測莪術治療陰道炎的潛在靶標及通路，最終為探索莪術抗陰道炎的具體機制提供依據。

在本研究中，最終預測得到莪術藥對抗陰道炎的7個化合物和14個作用靶點，其活性成分多樣性和作用靶點多樣性在一定程度上體現了成分和靶點之間復雜的相互作用，在一定程度上解釋了“異病同治，同病異治”的物質基礎。通過基因富集分析發現莪術治療陰道炎的分子功能涉及類固醇激素受體、轉錄因子活性/配體調控特異性序列DNA結合、核受體活性等方面；主要生物過程涉及女性妊娠的母體過程、妊娠的乳腺分支導管、前列腺上皮形態形成、分支導管參與乳腺導管形態發生、前列腺形態發生等方面。KEGG通路富集分析發現，莪術活性成分相關靶點PGR、NCOA2、CTSD、ESR1、RXRA參與了雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路。其中雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)由雌激素與雌激素受體結合后可以調節細胞核中的基因轉錄，或者激活細胞質中的激酶進而發揮其作用，雌激素主要參與炎癥反應、新陳代謝、心肌細胞和干細胞的存活。研究表明，雌激素替代療法已被成功用于陰道炎，但激素替代療法可能會增加乳腺癌、冠心病和其他疾病的發生[8]。因此，優選一種安全的替代方案值得我們去探討。我們猜測莪術可通過調控雌激素信號通路促進雌激素的分泌來改善陰道炎的發生發展過程，具體的作用機制有待進一步探討。甲狀腺信號相關通路是甲狀腺功能的重要組成部分，當甲狀腺功能異常時，其信號通路會出現異常。查閱國內外文獻，目前尚無甲狀腺激素及甲狀腺受體與陰道炎相關性的研究；結合我們的網絡藥理預測的結果，推測莪術可通過調控甲狀腺信號通路來影響激素的分泌從而改善陰道炎的發生發展過程，仍需進一步實驗驗證。本研究發現，莪術治療陰道炎的靶點參與了雌激素信號通路(4個靶點)、甲狀腺激素信號通路(3個靶點)，表明莪術中的活性成分可能通過參與上述通路，進而減輕機體炎癥反應、從而發揮治療陰道炎的作用。

本實驗運用網絡藥理學的方法報道莪術抗陰道炎的作用機制，成功地預測了莪術治療陰道炎主要作用的靶點與相關的信號通路，發現莪術通過多成分作用于多靶點發揮藥理作用，為進一步深入探討作用機制奠定基礎。