腦膠質瘤患者血清microRNA-375的表達水平及臨床意義

白曉斌，霍龍偉，謝萬福，徐高峰，王茂德

（1.西安交通大學第一附屬醫院 神經外科，陜西 西安 710061；2.榆林市第一醫院 神經外科，陜西 榆林 719000）

腦膠質瘤的發病機制復雜，主要為抑癌基因失活和原癌基因激活產生的一系列動態演變和基因異常的結果[1]。MicroRNA（miRNA）為一種新的非編碼RNA，miRNA 參與多種病理生理過程，為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路[2]。血清miRNA 水平比較穩定，檢測血清miRNA 水平在惡性腫瘤的診治及預后評估中具有重要價值[3]。miRNA-375 在多種惡性腫瘤中異常表達，其表達水平在多種惡性腫瘤診治中具有重要意義[4-7]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2013年12月西安交通大學第一附屬醫院神經外科收治的腦膠質瘤患者120 例作為腦膠質瘤組，選取同期本院健康體檢群眾120 例作為對照組。腦膠質瘤組患者中男性64 例，女性56 例；年齡（53.46±6.14）歲；腦葉部53 例，腦干和小腦部67 例；腫瘤直徑（3.14±0.61）cm，術前KPS 評分（86.37±11.25）分；世界衛生組織病理分級Ⅰ級 28 例，Ⅱ級34 例，Ⅲ級45 例，Ⅳ級13 例。對照組男性62 例，女性58 例；年齡（54.13±5.78）歲。納入標準：腦膠質瘤患者病理確診為腦膠質瘤，術前卡氏評分（Kanofsky performance score,KPS）＞50 分，術前未接受放化療及生物免疫治療等相關治療，進行腦膠質瘤手術治療。排除標準：精神意識障礙無法溝通，自身免疫性疾病，其他惡性腫瘤，嚴重心、肺、肝及腎等重要臟器疾病，未正規隨訪或失訪者。本研究經本院倫理委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）測定血清miRNA-375 水平。取患者外周靜脈血，分離血清，加入RNA 酶混勻，采用酚-氯仿法進行裂解，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用RT-PCR 測定血清miRNA-375 水平，PCR 反應條件：95℃預變性20 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共42個循環。采用2-ΔΔCt法計算血清miRNA-375 水平。RT-PCR 儀器和相應試劑盒均購自美國Sigma 公司。

1.3 隨訪

術后電話或門診隨訪，手術結束時間為隨訪開始時間，術后死亡時間或隨訪截止時間為隨訪結束時間，隨訪截止時間為2018年12月31日。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；Kaplan- Meier 法繪制ROC 曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析用多因素Logistic 回歸模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者血清miRNA-375 相對表達量比較

腦膠質瘤組miRNA-375 相對表達量為（0.48± 0.09），對照組為（1.00±0.05），經t檢驗，差異有統計學意義（t=55.327，P=0.000），腦膠質瘤組低于對照組。見圖1。

圖1 兩組患者血清miRNA-375 相對表達量比較 （n =120，±s）

2.2 不同因素患者血清miRNA-375 水平比較

不同術前KPS 評分、病理分級患者血清miRNA-375水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），術前KPS 評 分≥80 分、病理分級Ⅲ和Ⅳ級患者血清miRNA-375 水平低于術前KPS 評分＜80 分、病理分級Ⅰ和Ⅱ級患者。不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑患者的miRNA- 375 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同因素患者血清miRNA-375 水平比較 （±s）

表1 不同因素患者血清miRNA-375 水平比較 （±s）

因素 n miRNA-375 t 值 P 值性別 男 64 0.49±0.11 1.555 0.123 女 56 0.46±0.10年齡 ≥55 歲 49 0.50±0.12 1.415 0.160 ＜55 歲 71 0.47±0.11腫瘤部位 腦葉 53 0.50±0.15 1.506 0.135 腦干和小腦 67 0.46±0.14腫瘤直徑 ≥3 cm 66 0.46±0.14 1.825 0.071 ＜3 cm 54 0.51±0.16術前KPS 評分 ≥80 分 45 0.41±0.08 10.259 0.000 ＜80 分 75 0.59±0.10病理分級 Ⅰ、Ⅱ級 62 0.61±0.11 12.457 0.000 Ⅲ、Ⅳ級 58 0.39±0.08

2.3 血清miRNA-375 水平與腦膠質瘤臨床病理特征的Logistics 回歸分析

以血清miRNA-375 水平作為因變量，以性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、術前KPS 評分及病理分級作為自變量，采用二分類Logistics 回歸分析，結果顯示，血清miRNA-375 水平與腦膠質瘤術前KPS評分和病理分級相關（P＜0.05）。見表2。

2.4 血清miRNA-375 對腦膠質瘤的診斷價值

血清miRNA-375 診斷腦膠質瘤的ROC 曲線下面積為0.871，血清miRNA-375截斷值（臨界值）為0.547，敏感性為89.36%（95% CI：0.468，0.964），特異性為90.13%（95% CI：0.493，0.978）。見圖2。

2.5 血清miRNA-375與腦膠質瘤預后的關系

以血清miRNA-3750.547 為界，分為低表達miRNA-375 和高表達miRNA-375 患者。低表達miRNA-375 患者總生存時間為（25.37±9.02）個月，無進展生存時間為（15.21±4.02）個月，高表達miRNA-375 患者總生存時間為（35.19±9.16）個月，無進展生存時間為（19.25±3.43）個月，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=4.937 和7.318，P=0.011和0.009），低表達miRNA-375 患者均低于高表達miRNA-375 患者。見圖3、4。

表2 血清miRNA-375 水平與腦膠質瘤臨床病理特征的Logistics 回歸分析參數

圖2 血清miRNA-375 診斷腦膠質瘤的ROC 曲線

圖3 兩組患者總生存時間的生存曲線

圖4 兩組患者無進展生存時間的生存曲線

3 討論

腦膠質瘤在成年人中多見，中青年是腦膠質瘤的高發年齡，腦膠質瘤常用的治療方法為手術治療、放射治療和化學治療。以手術為主的綜合治療在個別早期膠質瘤患者中取得了較好的療效，但大部分膠質瘤、特別是高級別腦膠質瘤的死亡率仍比較高[8]。除手術治療、放射治療和化學治療外，其他治療方法尚處在實驗階段，沒有在臨床上推廣。目前最準確的診斷腦膠質瘤的方法為組織病理學檢測，但該方法需要外科手術獲得標本，為有創性操作，因此探索操作方便、敏感性和特異性較高的膠質瘤治療方法具有重要 價值[9]。

miRNA 為含有19 ～25 個核苷酸的一種單鏈核糖核酸，在多種病理生理過程中發揮作用。研究發現，miRNA 在多種惡性腫瘤的發生、發展中具有重要的調控作用，在惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲等過程中也發揮重要的調節作用[10]。有研究發現多種miRNA 和腦膠質瘤的關系也比較密切，在腦膠質瘤的增殖、侵襲遷移及腦膠質瘤的診斷及預后判斷中具有重要價值[11]。

miRNA-375 的生物學功能比較強大，可調控一系列基因的轉錄，參與葡萄糖有關的胰島素分泌，參與細胞生長和增殖的調控；在多種惡性腫瘤中表達異常，與多種惡性腫瘤的轉移和預后關系密切，如miRNA 375 可調節非小細胞肺癌細胞的存活和凋亡[12]；miRNA 375 在食管癌組織中呈低表達，與食管癌的分化程度、淋巴結轉移和TNM 分期關系密切，參與食管癌的發生、發展[13]；上調miRNA-375 可增加人胃癌細胞的順鉑敏感性[14]。ZHANG 等[15]研究發現，miRNA-375 在腦膠質瘤中的表達也存在異常，腦膠質瘤患者的腫瘤組織中miRNA-375 水平降低，過表達miRNA-375 可抑制腦膠質瘤細胞的發展。

血漿和血清中miRNA 比較穩定，在不同疾病中具有特異性，并且可以直接檢測出來。膠質瘤血清中多種miRNA 存在異常，多種血清miRNA 可作為膠質瘤診斷和預測進展的標志物[16-17]。在多種惡性腫瘤血清中miRNA-375 也存在異常，如前列腺癌、乳腺癌及原發性肝癌患者血清中miRNA-375 水平均存在異常，與患者則預后關系密切，可作為預后判斷的生物標志物[18-20]。本文對腦膠質瘤患者血清miRNA-375水平進行研究，發現腦膠質瘤患者血清miRNA-375水平降低，血清miRNA-375 水平與腦膠質瘤的術前KPS 評分和病理分級關系密切，其診斷腦膠質瘤的ROC 曲線下面積為0.871，敏感性為89.36%，特異性為90.13%；低表達miRNA-375 患者總生存時間和無進展生存時間均低于高表達miRNA-375 患者，表明血清miRNA-375 在腦膠質瘤的診斷和預后預測中具有重要價值。

綜上所述，腦膠質瘤患者血清miRNA-375 水平降低，血清miRNA-375 有望成為腦膠質瘤診斷和預后判斷的潛在生物標志物。