膽汁及膽囊黏膜中骨橋蛋白、瘦素、內脂素及脂聯素的表達及意義

鄒旺生，陳健，張宏

（1.銅陵市人民醫院 急診外科，安徽 銅陵 244000；2.貴州醫科大學附屬醫院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004）

膽囊結石是膽道系統中一種常見的良性疾病，綜合發病率約為10%[1]。其中最常見的類型為膽固醇結石，約占90%[2-3]。膽固醇結石的形成可能與膽汁膽固醇過飽和，膽固醇結晶成核時間，膽囊運動減弱，基因和環境等因素共同作用有關[4]。目前國內外對結石形成與發展所處的內環境（膽汁）及膽囊黏膜的研究相對缺乏。本研究旨在通過檢測膽汁及膽囊黏膜中瘦素、內脂素、脂聯素及骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）等指標或表達差異，為臨床膽固醇結石的進一步防治提供潛在可能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2018年12月在貴州醫科大學附屬醫院肝膽外科行腹腔鏡膽囊切除術的74 例患者作為觀察組，術后均證實為膽固醇結石。其中，男性21 例，女性53 例。另選取30 例手術切除膽囊的非膽囊結石患者作為對照組。其中，男性9 例，女性21 例；根據膽囊是否有息肉將對照組分為對照息肉組和對照正常組，分別為22 和8 例。對照組患者術前均無膽囊結石病史，術中確認膽囊無結石、結晶及膽汁淤積、腫瘤侵襲等。

1.2 材料與試劑

1.2.1 標本采集 記錄患者年齡、身高、體重，計算BMI。所有患者膽囊切除后迅速從膽囊中抽取膽汁5 ～10 ml，然后剖開膽囊采集結石。在膽囊床對側的膽囊壁內（遠離電刀分離面），用剪刀沿黏膜下行銳性剝離，取膽囊壁全層約4 cm2置于10%甲醛中留作病理染色使用。膽汁置于-80℃保存，膽石經磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）漂洗、烘干后室溫存儲。

1.2.2 試劑 Western blotting 一抗（美國Abcam 公司），酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（美國Rapidbio 公司），氧化酶法試劑盒（南京建成生物工程研究所）

1.2.3 儀器與設備 分光光度計、離心機（德國Eppendorf 公司），37℃水浴鍋、95℃金屬浴鍋（北京田園奧瑞生物科技有限公司），膠片曝光機SRX-101A（日本Konica Minolta 公司）

1.3 方法

1.3.1 膽汁成分測定 膽汁3 000 r/min 離心10 min 取上清，檢測瘦素、內脂素、脂聯素、膽固醇、磷脂及總膽汁酸等。按ELISA 試劑盒說明書操作，用Excel 軟件繪制出的標準品線性回歸曲線（曲線經校正為直線），按曲線方程計算各樣本濃度值。膽汁中膽固醇按總膽固醇的檢測（氧化酶法）試劑盒說明書操作。

1.3.2 膽固醇飽和指數（cholesterol saturation index,CSI）測定 利用膽汁中膽固醇濃度、磷脂和總膽汁酸濃度計算出膽汁總脂濃度和磷脂百分比并通過查Carey 表算出CSI[5]。

1.3.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色 常規石蠟包埋和切片：從10%甲醛固定標本中剪取部分膽囊全層組織，按沖洗→梯度脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片烘片流程操作。切片厚度5μm。HE 染色：切片置于60℃溫箱烤片熔蠟30 min，分置二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，無水、95%、85%及75%酒精梯度脫水，蘇木精染色5 min，流水沖洗。0.5%鹽酸酒精分化20 s，自來水洗2 min，梯度酒精脫水，0.5%伊紅染色3 min，蒸餾水速洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.4 免疫組織化學染色 為進一步觀察差異表達基因OPN 在膽囊黏膜的表達部位，對膽囊組織進行免疫組織化學染色，用PBS 代替一抗作內參對照。石蠟切片二甲苯Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ脫蠟各10 min，無水酒精、90%酒精、80%及70%酒精梯度脫水各2 min。PBS漂洗2 min/次，共3 次，浸入枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸（微波抗原修復），高火2 min，再維持10 min，取出自然冷卻后PBS 漂洗2 min/次，共3 次。過氧化氫H2O2和甲醇按1 ∶9 比例孵育5 ～10 min（去除內源性過氧化物酶）。切片加2 滴5%胎牛血清白蛋白封閉液封閉。室溫放置20 min 后，輕輕甩去封閉液，不洗，加入抗體稀釋液1 ∶200 稀釋的一抗40μl，置于濕盒中。4℃冰箱孵育過夜。PBS 漂洗5 min/次，共3 次，加二抗40μl，室溫孵育1 h。PBS 漂洗5 min/次，共3 次。二氨基苯聯胺顯色，室溫下鏡下觀察3 ～10 min。陽性產物呈棕黃色，觀察到陽性產物后立即終止反應。蘇木精襯染細胞核，鹽酸酒精水洗藍化，80%、90%及無水酒精梯度酒精脫水，二甲苯透明5 min，干燥后用中性樹脂封片，鏡下觀察。所有圖片采用Image pro plus 6.0 軟件行光密度（optical density,OD）值 分析。

1.3.5 Western blotting ①黏膜組織勻漿及樣品制備：將組織放入10 ml離心管，加入細胞裂解液1 ml（pH 8.0 的1 mmol/L Tris-HCl 50μl，5 mmol/L NaC1 30μl；NP-40 10μl，0.5 mmol/L EDTA 4μ1，0.5 mmol/L 去氧膽酸鈉10μl，100 mmmol/L PMSF 10μl，2 mg/ml Leupeptin 5μl，2 mg/ml Aprotinin 2.5μl，0.5 mmol/L 焦磷酸鈉l0μl，10% SDS l0μl，三蒸水定容至1.0 ml），充分勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，去上清分裝成20μl/管。分光光度計測濃度，加入三蒸水使每管濃度為25μg/ml，再加入等體積的Sample Buffer（10% SDS 2.0 ml，甘油1.0 ml，pH 6.8 的0.5 mol Tris-HC1 1.6 ml，β- 巰 基 乙 醇0.5 ml，Western blotting protein ladders 10μl，三蒸水定容至10 m1）混勻備用。使用前90℃煮沸10 min，短暫離心，按25μg/孔蛋白上樣。②電泳：垂直電泳槽中加入分離膠（三蒸水4 ml，30% Acrylamide 3.3 ml，pH 8.8 的1.5 mmol/L Tris-HCl 2.5 ml，10% SDS 1OOμl，10% APS 100 μl，最后加入10% TEMED 10μl 占下3/4），用注射器注入濃縮膠（三蒸水1.4 ml，30% Acrylamide 0.4 ml，pH 6.8 的0.5 mmol/L Tris-HCl 0.63 ml，10% SDS 50μl，10% APS 12μl，10% TEMED 5μ1），插上梳子，室溫聚合1 h。待膠完全聚合后取下梳子，每樣上2 塊平行膠，蛋白上樣70μl/孔；上樣完畢后電泳槽中加入電泳緩沖液（25 mmol/L Tris 3.03 g，192 mmol/L 甘氨酸14.42 g，pH 8.0 的0.1% SDS l g），電泳先以80 V 電壓進行，待Protein Ladders 入分離膠后將電壓改為120 V 恒定電壓進行，電泳至Protein Ladders到底邊處停止電泳，取出凝膠。③轉膜：電泳完畢將膠取下做好標記，按塑料孔板（黑）-海綿-濾紙-電泳凝膠-PVDF 膜-濾紙-海綿-塑料孔板（白）的順序做好三明治，放于電轉膜液中（甘氨酸11.26 g，Tris 2.42 g，20%甲醇500 ml，pH 8.0）轉膜，400 mA 恒流電轉移1.5 h。④抗體孵育：取下電轉移的PVDF 膜，1×TBST 洗膜3 次，10 min/次，置于5% BSA 中常溫封閉1 h。加入1 ∶1 000 稀釋的一抗，4℃恒溫孵育過夜，取出PVDF 膜用1×TBST 洗膜3 次，10 min/次，加入1 ∶5 000 稀釋的相應二抗，37℃恒溫孵育1 h，1×TBST 洗膜3 次，10 min/次。 ⑤顯影：取WestPico Chemiluminescent Substrate ECL試劑A、B 液各1 ml 混勻，每張PVDF 膜用1 ml A、B 混合液浸潤約5 min 后放入暗盒固定，在暗室以膠片覆蓋后關上暗盒20 s ～5 min，取出膠片后放入顯影洗片機中顯影，取出膠片觀察結果。Western blotting 圖片采用Image J 軟件進行條帶灰度值數據 處理。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析，方差不齊時改用H檢驗，進一步兩兩比較用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者男女性構成比、年齡、BMI 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組患者膽汁成分比較

兩組患者膽固醇、磷脂、總膽汁酸、膽固醇百分比、總脂及CSI 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組膽固醇、膽固醇百分比、總脂及CSI 高于對照組，觀察組磷脂、總膽汁酸低于對照組。見 表2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 兩組患者膽汁成分比較 （±s）

表2 兩組患者膽汁成分比較 （±s）

組別 n 膽固醇/ （mmol/L） 磷脂/（mmol/L） 總膽汁酸/（mmol/L） 百分比/% 磷脂百分比/% 總膽汁酸 百分比/% 總脂/（g/dl） CSI 膽固醇 觀察組 74 18.87±1.64 37.42±5.45 119.07±11.20 10.16±0.60 21.17±0.76 68.8±1.25 16.93±1.49 1.72±0.37對照組 30 10.55±1.03 59.77±6.03 176.53±14.23 4.05±0.22 24.21±1.07 71.80±1.14 11.76±1.16 0.95±0.15 t 值 10.273 24.511 56.581 5.311 7.870 30.435 8.122 2.290 P 值 0.005 0.041 0.033 0.028 0.093 0.115 0.012 0.006

2.3 兩組患者膽汁中瘦素、內脂素及脂聯素 比較

兩組患者膽汁中瘦素、內脂素及脂聯素比較，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組膽汁中瘦素、內脂素高于對照組，觀察組膽汁中脂聯素低于對照組。見表3。

表3 兩組患者膽汁中瘦素、內脂素及脂聯素比較 （±s）

表3 兩組患者膽汁中瘦素、內脂素及脂聯素比較 （±s）

脂聯素/ （μg/ml）觀察組 74 7.14±3.75 12.02±3.39 7.4±1.65對照組 30 3.08±1.27 8.15±2.45 11.3±3.26 t 值 4.239 6.625 5.331 P 值 0.008 0.038 0.005組別 n 瘦素/ （ng/ml）內脂素/ （ng/ml）

2.4 各組膽囊黏膜HE 染色結果

觀察組膽固醇結石患者近3 個月無急性發作史，膽囊黏膜呈慢性膽囊炎表現，沒有黏膜萎縮，囊壁增厚不明顯。鏡下見黏膜有增生，單核細胞浸潤。部分黏膜下可見泡沫細胞，表明有膽固醇沉積。少數黏膜內可見淋巴結以及杯狀細胞，提示腸化。對照息肉組患者與對照正常組患者鏡下見膽囊黏膜炎癥細胞浸潤較輕。見圖1。

2.5 各組膽囊黏膜中OPN 的表達

免疫組織化學結果顯示，觀察組患者膽囊黏膜OPN 主要表達在膽囊黏膜上皮細胞的頂端膜上，部分胞漿內也可看到表達的顆粒。對照息肉組患者膽囊黏膜中較少表達，對照正常組患者膽囊黏膜中無表達。見圖2。

圖1 各組膽囊黏膜 （HE 染色×200）

圖2 各組膽囊黏膜中OPN 的表達 （×200）

2.6 各組OPN 的OD 值比較

觀察組OPN 的OD 值為（0.27±0.04），對照息肉組為（0.11±0.06），對照正常組為（0.03±0.01），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=3.876，P=0.020），但方差齊性levene 檢驗結果P=0.012，提示方差不齊，故改用非參數檢驗H 檢驗，差異有統計學意義（Z=12.283，P=0.029）；進一步兩兩比較，觀察組與對照息肉組比較，差異有統計學意義（χ2=0.246，P=0.012）；觀察組與對照正常組比較，差異有統計學意義（χ2=0.092，P=0.003）；對照息肉組與對照正常組比較，差異有統計學意義（χ2=0.179，P=0.035）。見圖3。

2.7 各組OPN 蛋白相對表達量比較

Western blotting 結果顯示，觀察組OPN 蛋白相對表達量為（0.88±0.13），對照息肉組為（0.33±0.07），對照正常組為（0.08±0.05）經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=5.374，P=0.039），但方差齊性levene 檢驗結果P=0.025，提示方差不齊，故改用非參數檢驗H檢驗，差異有統計學意義（Z=29.845，P=0.017）；進一步兩兩比較，觀察組與對照息肉組比較，差異有統計學意義（χ2=0.133，P=0.027）；觀察組與對照正常組比較，差異有統計學意義（χ2=0.034，P=0.008）；對照息肉組與對照正常組比較，差異有統計學意義（χ2=0.291，P=0.015）。見圖4、5。

圖4 各組OPN 蛋白的表達

圖5 各組OPN 蛋白相對表達量比較 （±s）

3 討論

瘦素由人體脂肪細胞分泌，它可以通過調節脂質代謝，影響膽囊收縮功能，并通過調節膽汁蛋白成分等機制促進膽固醇結石的形成[6]。脂聯素由人體脂肪組織合成，具有Adipo1（R1）、Adipo2（R2）兩種受體，R1 多在骨骼肌表達，而R2 主要在肝臟表達。胰島素可抑制膽鹽合成限速酶7α 羥化酶，使膽汁酸減少分泌，同時也使膽汁中鈣離子升高，黏多糖增多，打破了膽汁抗成核及促成核因子的動態平衡[7-8]。目前有研究認為膽固醇結石患者體內脂聯素的水平較低，這在一定程度上降低了胰島素的敏感性并使胰島素抵抗增加，胰島素的水平相對增高。胰島素與脂聯素的關系密切，兩者協同作用，共同參與了膽固醇結石的形成[9]。內脂素可通過下調THP-1 源性巨噬細胞的人源脂類外向轉運蛋白ABCA1 的表達，減少細胞內游離膽固醇外流，同時使乙酰輔酶A 乙酰轉移酶1 表達增高，增加了細胞內膽固醇的合成，促進了泡沫細胞的形成[10-11]。脂肪細胞中的膽固醇負荷增加，可使脂肪細胞分泌內脂素增加，其機制可能與脂肪細胞的內質網應激增強有關[12]。這也為內脂素導致膽固醇性結石形成的機制研究提供了新的理論依據。而筆者實驗中觀察組相對于對照組，膽汁中的瘦素、內脂素水平升高，脂聯素降低，基本與以上理論相吻合。

水溶性極差的膽固醇在膽汁中主要以膽固醇、膽鹽及磷脂混合的微膠粒相形式存在[13]。有研究通過檢測膽囊結石患者的膽汁發現，膽鹽和磷脂可以影響膽固醇在膽汁中的溶解度，它們之間存在熱力學平衡。結石患者的膽汁中膽固醇出現熱力學失衡，更易過飽和析出產生結晶，最終導致膽囊結石的形成[14]。筆者的實驗結果中，觀察組相對于對照組，膽汁中的膽固醇濃度，CSI 升高，總膽汁酸和磷脂的濃度降低，由此推測膽汁中膽鹽減少，形成的微膠粒絕對不足，影響了膽固醇的溶解度，同時由于膽固醇濃度增高，形成的微膠粒相對不足，影響了其在膽汁中的溶解度，兩種原因共同導致膽固醇呈過飽和狀態并析出結晶形成結石。

OPN 可以通過調節膽汁代謝，改變膽汁的穩態，導致膽固醇結石的發生。其機制是肝臟內的OPN降低了肝臟中膽汁酸合成代謝的限速酶CYP7A1的表達，并增加了與膽固醇形成相關的基因SHP、ATP8B1、SR-B1及SREBP-2的表達，導致膽汁酸合成減少，膽固醇合成增加，加速了膽汁的成核作用。有研究報道，OPN 的缺乏可抑制腸道膽固醇轉運關鍵蛋白NPC1L1，而NPC1L1與膽固醇在腸道的吸收密切相關，NPC1L1 在腸道的表達減少可以導致膽固醇在腸道的吸收下降，間接使膽汁中膽固醇的含量降低，從而減少膽固醇結石的形成[15]。本實驗中，觀察組膽囊黏膜中OPN 的表達高于對照組，可能與以上機制 有關。