卵巢早衰患者血漿中miRNA-503的作用及對內皮祖細胞的影響

仝慧杰 劉麗麗 范志剛 李陽 馮曉娟

河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院（河北邢臺054000）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）指40歲之前的女性由于卵巢功能衰退而引發持續性閉經和性器官萎縮的綜合征［1］。卵巢動脈的血流阻力增加，灌注量降低是引起卵巢早衰的病理機制［2-3］。研究［4-6］發現，miRNA-503 具有抗血管生成的作用，參與調節多種血管生成因子，但是miRNA-503 是否參與卵巢早衰的血管抑制過程尚無報道。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內皮細胞的前體細胞，可遷移至損傷位點，支持或替代損傷的內皮細胞，從而發揮促血管生成的作用［7］。外周血中EPCs 數量降低以及功能減弱常見于各種疾病［8-10］，但是卵巢早衰患者外周血EPCs的變化，以及與miRNA-503 是否具有相關性，尚不清楚。綜上，本文旨在探討卵巢早衰患者血漿中miRNA-503水平和內皮祖細胞數量的變化，并且分析其相關性，以及miRNA-503與彩色多普勒血流動力學參數的關系，并且通過體外細胞學實驗研究miRNA-503對內皮祖細胞增殖和黏附的影響。

1 資料與方法

1.1 資料選取2016年1月至2018年12月于我院就診的24 例卵巢早衰患者作為卵巢早衰組，納入標準：（1）年齡≤40歲的已婚患者，月經初潮及第二性征發育正常；（2）閉經時間≥6 個月；（3）2 次或以上檢查發現血清FSH≥40 mIU/mL，兩次檢查需間隔1 個月以上。排除標準：（1）3 個月內服用過激素類藥物或針對卵巢早衰進行過治療；（2）合并腫瘤、高血壓等其他疾病。納入同期體檢、年齡相近（≤2 歲）的24 例健康女性作為對照組。收集兩組患者的一般資料進行比較，包括年齡、促卵泡激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）等。所有患者均已簽署知情同意書，本研究已獲倫理委員會批準。

1.2 血漿miRNA-503 含量的檢測實時熒光聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定miRNA-503的含量，常規對患者血漿行RNA 提取、逆轉錄、PCR 擴增等步驟。引物合成于上海生工生物工程有限公司，具體序列為：miRNA-503的上游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物：5′-GCTAGCAGCGGGAACAG-3′；U6的上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3 EPCs 數量的檢測抽取患者2 mL的抗凝靜脈血，淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）分離淋巴細胞。將細胞分別與APC-CD34 抗體（美國Thermo Fisher Scientific 公司）和FITC-VEGFR2 抗體（英國Abcam 公司）避光孵育10 min，洗滌后使用流式細胞儀檢測。

1.4 卵巢動脈血流動力學參數的檢測使用彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭Philips 公司）經陰道觀察卵巢基質內動脈血流，測量收縮期峰值流速（peak systolic velocity，PSV）、舒張末期流速（end-diastolic velocity，EDV）、阻力指數（resistive index，RI）、搏動指數（pulsatility index，PI）。

1.5 細胞學實驗

1.5.1 EPCs的分離、培養與鑒定參照文獻報道［11］進行實驗：分離外周血淋巴細胞后，使用EGM-2 完全培養基（瑞士Lonza 公司）以2×106個/L的密度接種于6 孔板中，放于37 ℃、5%CO2培養箱中，后續實驗均使用第3 代細胞。4%的多聚甲醛固定EPCs 細胞，加入Dil-LDL 染色液（工作濃度：2.4 mg/L，美國Molecular Probes 公司）與FITC-UEAI 染色液（工作濃度：10 mg/L，美國Sigma 公司）于37 ℃孵育1 h，倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.5.2 實驗分組與細胞轉染細胞學實驗分為4組，即正常對照組（A 組）、卵巢早衰組（B 組）、miRNA-503 inhibitor NC 組（C 組）、miRNA-503 inhibitor 組（D組）。A組使用無卵巢早衰女性分離得到的EPCs。其余三組均使用卵巢早衰患者分離得到的EPCs，B 組未進行轉染；C 組和D 組分別使用miRNA-503 inhibitor NC 和miRNA-503 inhibitor 轉染，按照LipofectamineTM 轉染試劑（美國Invitrogen 公司）說明書進行實驗。72 h 后使用qRT-PCR 測定四組細胞中miRNA-503的表達水平。miRNA-503 inhibitor和miRNA-503 inhibitor NC 由上海吉瑪制藥技術有限公司設計和合成。

1.5.3 IGF-1R 表達水平的檢測qRT-PCR 測定細胞中IGF-1R mRNA 表達水平，具體序列為：上游引物：5′-TCGACATCCGCAACGACTATC-3′，下游引物：5′-CCAGGGCGTAGTTGTAGAAGAG-3′。蛋白質免疫印跡（Western Blot，WB）測定四組細胞中IGF-1R蛋白質的表達水平，常規進行電泳、轉印等步驟，一抗稀釋比例為：抗IGF-1R 抗體（1∶1 000，英國Abcam 公司）和抗GAPDH 抗體（1∶2 000，英國Abcam 公司）。

1.5.4 EPCs 增殖能力的檢測將等量EPCs 細胞接種于96 孔板中，培養72 h，加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL），繼續孵育4 h，吸棄上清后加入二甲基亞砜振蕩10 min。酶標儀于490 nm 處測定各孔吸光度值（OD）。

1.5.5 EPCs 黏附能力的檢測將等量的EPCs 細胞接種于6 孔板中，放于37 ℃、5%CO2培養箱中30 min，PBS 洗去未貼壁的細胞，顯微鏡下計數貼壁細胞數。

1.6 統計學方法使用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。所有計量數據均表示為均數±標準差，兩組間計量數據的比較使用t檢驗，多組間計量數據的比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗。相關分析使用Pearson 法。所有計數數據均表示為患者例數，計數數據的比較使用χ2檢驗，等級頻數資料比較采用Mann-WhitneyU非參數檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料的比較與對照組比較，卵巢早衰組患者的FSH、LH、妊娠次數和人流次數升高，E2降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），其他一般資料差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data （n=24）±s

表1 一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data （n=24）±s

組別對照組卵巢早衰組t 或χ2值P 值年齡（歲）31.92±5.80 32.88±5.01 0.614 0.543體質量指數（kg/m2）22.10±2.99 21.87±3.12 0.261 0.796初潮年齡（歲）13.75±1.87 14.08±2.16 0.566 0.574首次分娩年齡（歲）25.18±4.25 25.90±4.83 0.548 0.586哺乳時間（月）7.28±3.23 7.69±3.57 0.417 0.679月經周期（d）29.44±3.12 28.72±3.66 0.733 0.467組別對照組卵巢早衰組t 或χ2值P 值經期（d）5.19±1.34 5.42±1.56 0.548 0.586 FSH（mIU/mL）4.65±1.52 63.44±18.70 15.350＜0.001 LH（mIU/mL）6.88±3.59 27.10±13.38 7.150＜0.001 E2（pg/mL）128.07±62.51 37.85±18.33 6.785＜0.001痛經（例）46 0.505 0.477妊娠次數（次）0.74±0.13 1.13±0.45 4.079＜0.001卵巢早衰家族史（例）15 3.048 0.081人流次數（例）0 次18 11 Mann-Whitney U=196.000 0.030 1 次46≥2 次27

2.2 miRNA-503 表達水平、EPCs 數量的比較及相關性分析qRT-PCR 結果顯示，對照組和卵巢早衰組miRNA-503 表達水平分別為（0.71 ± 0.05）、（1.62 ± 0.12），差異具有統計學意義（t= 6.769，P＜0.001）；EPCs 數量分別為（35.83±1.96）個/mL、（22.42±2.20）個/mL，差異具有統計學意義（t=4.558，P＜0.001）。miRNA-503 表達水平和EPCs 數量呈負相關（r=-0.713，P＜0.001）。見圖1。

2.3 卵巢早衰患者miRNA-503 與卵巢動脈血流動力學參數的相關性分析miRNA-503 表達水平與PSV 和EDV 呈負相關（r=-0.508，P= 0.011；r=-0.497，P= 0.014），與RI 和PI 呈正相關（r=0.450，P=0.027；r=0.491，P=0.015），差異具有統計學意義。見圖2。

圖1 miRNA-503 表達水平、EPCs 數量的比較及相關性分析Fig.1 Comparison and correlation analysis of the expression level of microRNA-503 and the number of EPCs

圖2 miRNA-503 與卵巢動脈血流動力學參數的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of microRNA503 and ovarian artery hemodynamic parameters

2.4 內皮祖細胞的鑒定FITC-UEA-I 染色陽性的細胞呈綠色熒光，Dil-Ac-LDL 染色陽性的細胞呈紅色熒光，合并圖片后呈橙黃色的細胞為雙重陽性染色細胞。見圖3。

圖3 內皮祖細胞的鑒定Fig.3 Identification of endothelial progenitor cells

2.5 miRNA-503 inhibitor 轉染后EPCs 中miRNA-503、IGF-1R的表達qRT-PCR 結果顯示，A 組、B組、C 組、D 組miRNA-503 表達水平分別為（1.00 ±0.16）、（2.31±0.37）、（2.24±0.31）、（1.16±0.29），差異具有統計學意義（F=134.800，P＜0.001）。miRNA-503 表達水平B 組、C 組高于A 組，且D 組低于B、C組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4A。

qRT-PCR 和WB 結果顯示，A 組、B 組、C 組、D組IGF-1R mRNA 表達水平分別為（1.00 ± 0.14）、（0.35±0.17）、（0.31±0.21）、（0.78±0.18），差異具有統計學意義（F= 86.680，P＜0.001）；IGF-1R 蛋白質表達水平分別為（1.00±0.15）、（0.48±0.19）、（0.42±0.20）、（0.81±0.19），差異具有統計學意義（F=53.900，P＜0.001）。以上指標B 組、C 組、D 組低于A 組，且D 組高于B、C 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4B、4C。

2.6 miRNA-503 inhibitor 轉染后EPCs的增殖和黏附B、C、D 組的增殖、黏附水平均低于A 組，且D 組高于B、C 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖4 miRNA-503 inhibitor 轉染后EPCs 中miRNA-503、IGF-1R的表達Fig.4 Expression of miRNA-503 and IGF-1R in EPCs after transfection with miRNA-503 inhibitor

表2 miRNA-503 inhibitor 轉染后EPCs的增殖和黏附Tab.2 Proliferation and adhesion of EPCs after transfection with miRNA-503 inhibitor ±s

表2 miRNA-503 inhibitor 轉染后EPCs的增殖和黏附Tab.2 Proliferation and adhesion of EPCs after transfection with miRNA-503 inhibitor ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.05；與卵巢早衰組比較，bP ＜0.05；與miRNA-503 inhibitor NC 組比較，cP ＜0.05

組別正常對照組（A 組）卵巢早衰組（B 組）miRNA-503 inhibitor NC 組（C 組）miRNA-503 inhibitor 組（D 組）F 值P 值增殖（OD 值）0.692±0.074 0.258±0.059a 0.231±0.063a 0.570±0.082abc 256.000＜0.001黏附（細胞數）69.40±8.51 32.77±6.19a 36.13±5.96a 61.82±9.08abc 140.700＜0.001

3 討論

卵巢早衰是各種原因導致的卵巢功能衰退，典型特征為FSH 和LH 水平升高，而E2水平降低，本研究也分析了納入患者的激素水平，與上述特征一致。卵巢早衰的發病危險因素包括妊娠、人流、家族史等，本文也發現卵巢早衰組患者的妊娠次數和人流次數高于對照組，與文獻［12］報道一致。雖然卵巢早衰組較對照組在家族史比例方面有升高的趨勢，但是差異無統計學意義，與文獻［12］報道不一致，可能與本文納入患者的數量較少有關。

卵巢動脈可以為卵泡成熟提供循環支持，影響著卵巢儲備功能，血流灌注降低是卵巢早衰的主要病理機制之一。近年研究發現，miRNA-503可以抑制血管生成，其表達水平受到一系列血管生成相關因素的調節，包括缺氧、炎癥等［13］。本文結果顯示卵巢早衰組miRNA-503 表達水平明顯升高，提示miRNA-503 可能在卵巢早衰的發生發展中發揮著重要的病理作用。而且彩色多普勒超聲及相關分析結果顯示，隨著miRNA-503 表達水平升高，卵巢動脈的血液灌注量降低，而血管阻力增加，表明miRNA-503 高表達與卵巢動脈血流動力學減退相關。目前臨床上對卵巢早衰患者的病情程度及療效評價仍然以癥狀、激素、經陰道超聲為主，但是這些指標的量化性能較差，而miRNA-503水平檢測可能為定量評價提供一個新的選擇［14］。

EPCs 是一類主要參與血管生成的多能干細胞［15-16］。在各種疾病中外周血EPCs 數量會發生改變，如DENG 等［17］發現急性缺血性中風患者的循環EPCs 水平顯著低于健康對照組。本文也檢測了CD34 和VEGFR2 雙陽性的EPCs 數量，發現卵巢早衰組患者較對照組外周血中EPCs 數量顯著降低，與上述文獻中的結論相近，即血管生成能力不足的疾病常伴隨有較低數量的循環EPCs。

miRNA 參與調節EPCs 增殖、黏附等功能［18］。本文對miRNA-503 表達水平和EPCs 數量進行相關性分析，結果顯示兩者呈負相關，表明miRNA-503致卵巢早衰血流動力學減退的機制可能與EPCs有關。為了進一步探討miRNA-503 對EPCs的影響，本研究分離和培養了卵巢早衰患者EPCs，使用miRNA-503 inhibitor 轉染可使細胞增殖和黏附水平升高，提示miRNA-503 對EPCs 功能具有抑制作用。ZHU 等［19］在研究缺氧誘導心肌細胞凋亡時發現，miRNA-503 可靶向作用于IGF-1R。因此，IGF-1R 可能是miRNA-503 下游靶基因，本文結果也顯示miRNA-503 inhibitor 轉染可促進IGF-1R的表達，間接證實了這一結論。

綜上所述，卵巢早衰患者血漿中miRNA-503高表達，與EPCs 數量減少及卵巢動脈血流動力學減退相關。miRNA-503 在卵巢早衰EPCs 中高表達，miRNA-503 inhibitor 轉染后可增強EPCs 增殖和黏附能力，可能與IGR-1R 表達上調有關。