山東茶葉輕穩定同位素和礦物元素特征與產地識別化學計量學分析

聶 晶 張永志 趙 明 邵圣枝 劉 志 王 鈁 袁玉偉,* Karyne M.Rogers

(1 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021；2 農業農村部農產品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021；3 青島市農業科學研究院，山東 青島 266100；4 新西蘭GNS國家同位素中心，惠靈頓 下哈特 5040，新西蘭)

茶葉起源于中國，已成為當今世界最為暢銷的飲品之一，深受人們的喜愛。作為我國重要的經濟農作物，茶葉種植范圍廣泛，種類眾多，文化底蘊深厚，地域特色和品質特征明顯，是典型的地理標志保護產品[1-2]。目前，國內50多個產地的茶葉品種已獲批地理標志保護產品，如龍井茶、普洱茶和信陽毛尖茶等。這些地理標志產品主要分布在長江以南地區，江北地區則主要集中在山東青島、日照、臨沂和泰安等地，尤以嶗山綠茶和日照綠茶最受歡迎[3]。這兩地茶葉自上個世紀60年代“南茶北引”以來，經長期在沿海地帶栽種培養，形成了外形粗壯、肥大，具有滋味濃厚、耐沖泡等地方特色[4-6]。

茶樹是一種喜暖、喜濕、喜酸的植物[7]，受光照、氣候、降雨和地理位置等因素影響，因此不同環境中，茶樹中的有機組分、特征官能團、礦物元素含量或同位素比和穩定同位素比值表現出一定的地域特征。近年來，研究人員利用不同分析技術對茶葉中各種組分進行測試建立指紋圖譜，并開展不同產地識別的化學計量學分析研究。利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)[8-9]、毛細管電泳[10-11](capillary electrophoresis, CE)對茶多酚類化合物和咖啡因進行了定量分析，氣相色譜質譜聯用(gas chromatograph mass spectrometer, GC-MS)[12-13]對茶葉中的香氣成分進行定性及定量檢測，上述方法結合主成分分析(principal component analysis，PCA)建立產地模型，利用傅里葉紅外光譜技術對茶葉中特征官能團進行掃描分析，分別用偏最小二乘(partial least squares, PLS)[14]和PCA[15]對不同產地茶葉開展產地溯源研究。元素分析-穩定同位素比率質譜(elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)和電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)等檢測技術以地球化學手段在茶葉溯源研究中已有研究實例，且2種方法與地理因素密切相關，不易受加工方式、氣候條件等因素的影響[16]。國外已在亞洲、非洲開展了與產地相關的穩定同位素和礦物元素的茶葉品種(紅茶、綠茶、花茶及烏龍茶)的研究，并取得了較好的應用成果[17-18]。穩定同位素比值(δ值)能反映生物生長環境信息及其對環境變化的適應特性，其中，δ15N能夠揭示植物體施有機肥或化肥的情況[19-20]；礦物元素多與生物體所生長的環境地質息息相關[21]，栽培方式也會影響礦物元素含量的變化。將上述2種檢測手段共同用于茶葉產地溯源，可有效提高判別結果的準確性和穩定性。目前，文獻報道主要針對國家、省份等地理尺度較大的產品識別[22-24]，且化學計量學方法均應用于大尺度地理范圍的產品判別分析，而小尺度地理范圍(省內)的判別方法有待考證。

為研究山東不同產區茶葉的輕穩定同位素和礦物元素特征，采用EA-IRMS和ICP-MS測定了山東各茶葉產地(青島嶗山和膠南、日照、臨沂-泰安等地區)的茶葉樣品，分析相關同位素和礦物元素的測定值與產地特征影響因素，以期為地理尺度更小的茶葉產地判別和地理標志產品保護提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2013-2015年茶葉樣品由青島(嶗山和膠南)、日照、臨沂-泰安等地的茶葉企業提供，總樣品量為137份。各產地地理位置見圖1，各年份、產地樣品信息如表1所示。

圖1 青島(嶗山、膠南)、日照、泰安-臨沂地理位置圖Fig.1 Geographical map of Qingdao(Laoshan, Jiaonan), Rizhao, and Taian & Linyi

表1 茶葉樣品數量及原產地Table 1 The amount of tea samples and their origin

硝酸和過氧化氫，分析純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司；穩定同位素標準物質IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.449‰±0.033‰)、IAEA-600(咖啡因，δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰，δ15Nair=-1.0‰±0.2‰)、IAEA-N-2(硫酸銨，δ15Nair=20.3‰±0.2‰)、IAEA-601(苯甲酸，δ18OV-SMOW=23.14‰±0.19‰)、IAEA-602(苯甲酸，δ18OV-SMOW=73.35‰±0.39‰)、IAEA-CH-7(聚乙烯，δ2HV-SMOW=-100.3‰±2.0‰)，均購自國際原子能機構(IAEA，奧地利)；B2203(δ2HV-SMOW=-25.3‰±1.1‰)購自Elemental Microanalysis公司(英國)。礦物元素測定所用標準物質均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心(北京，中國)。

1.2 主要儀器與設備

XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Vario PYRO cube型元素分析儀，德國Elementar公司；Isoprime100型穩定同位素比率質譜儀，英國Isoprime公司；Mars 5型微波消解儀，美國CEM公司；X-series Ⅱ型電感耦合等離子體質譜儀，美國Thermo Fisher公司;HR2864粉碎機，中國飛利浦。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 茶葉樣品用粉碎機進行粉碎處理，并將粉碎完成的樣品過60 目篩，避光常溫保存，待測。

1.3.2 穩定同位素比值測定

1)C和N同位素：稱取茶葉樣品2.0～4.0 mg，放入錫箔舟中包樣；按編號將包樣放入元素分析儀的固體樣品自動進樣盤。樣品中碳、氮元素在經燃燒還原后分別轉化為CO2和N2，進入穩定同位素比率質譜儀進行檢測。儀器具體參數：元素分析儀燃燒爐和氧化爐的溫度分別為920和600℃，載氣氦氣，流量為250 mL·min-1。

2)H和O同位素：稱取茶葉樣品0.4～0.6 mg，放入銀舟中包樣；按編號放入元素分析儀自動固體樣品進樣盤中。樣品中的氫、氧元素在經高溫裂解分別轉化為H2和CO，進入穩定同位素比率質譜儀進行檢測。儀器具體參數：元素分析儀裂解爐溫度為 1 450℃，氦氣流量為150 mL·min-1。

3)穩定性同位素比率值：參照下列公式計算：

(1)

式中，R樣品為所測樣品中重同位素與輕同位素豐度之比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標準為國際標準樣品中重同位素與輕同位素豐度比。

測試數據均采用兩點校正法進行處理定值，即δ13CV-PDB采用IAEA-CH-6、IAEA-600標準物質值校正，δ15Nair采用IAEA-N-2、IAEA-600標準物質值校正，δ18OV-SMOW采用IAEA-601、IAEA-602標準物質值校正，δ2HV-SMOW采用B2203、IAEA-CH-7標準物質值校正。

1.3.3 礦物元素含量及鉛同位素比測定 稱取0.5 g的茶葉樣品于微波消解罐中，加入4.0 mL 2.0 mol·L-1硝酸和2.0 mL 30%過氧化氫，室溫下預消解20 min后，擰上蓋子，放入微波消解儀消解。消解完成后，冷卻至室溫取出內罐，將消解液轉移至50 mL容量瓶并用超純水定容，待測。同位素比測定選取同位素比率測定模式，礦物元素含量測定時用銠和錸作為內標溶液(1.00 ng·mL-1)，監控和校正儀器漂移。

1.4 數據處理及模型建立

首先采用SPSS 18.0(美國IBM公司)對數據進行單因素方差分析(one way-ANOVA)，使用兩兩類別比較方法對各檢測元素進行數據分析處理。然后利用SIMCA-p13.0(Umetrics，德國Sartorius公司)進行偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)。

2 結果與分析

2.1 山東不同產地茶葉輕同位素比率特征

根據地理位置分布，嶗山、膠南和日照均為沿海地區，泰安-臨沂為沿海內陸地區，各地茶葉中輕同位素比率結果如表2所示。除膠南與嶗山茶葉中的δ15N值具有顯著差異外，其他地區的穩定同位素比值不存在顯著性差異，而δ13C、δ2H和δ18O值范圍變化較小，無顯著差異。δ15N值的變化范圍較小(2.5‰～4.0‰)，且膠南產地值最小，這可能與茶葉施氮肥方式和種類相關；δ13C值變化為-25.7‰～-24.9‰，各地差異不顯著；δ2H和δ18O總體數值變化不大，變化范圍分別為-66.2‰ ～ -60.4‰和24.7‰～27.3‰，δ2H和δ18O值依此遞減的次序為膠南>嶗山>日照>泰安-臨沂產地。結合地理位置可得出，從沿海地區到內陸地區2種穩定同位素比值逐漸下降，該趨勢與降水穩定同位素相同，即降水穩定同位素會隨著遠離海岸線而逐漸貧化，形成“大陸效應”，此類效應對大陸的沿海地區更為顯著[25]。此外，對以上產地茶葉δ2H 和δ18O相關線性分析(圖2)，各地的相關性良好，其中沿海地區的相關性高于沿海內陸地區。如膠南茶葉中氫氧同位素R2達到0.817 5，嶗山茶葉中氫氧同位素R2為0.696 1，日照茶葉氫氧同位素R2為0.595 6，而內陸地區(臨沂-泰安)R2僅為0.401 7；同時，各地氫、氧相關性的排序與同位素平均值的排序相同，即沿海地區高于沿海內陸地區。由此可見，降水對該類地區茶葉葉片同位素比值的影響具有重要意義。

表2 山東不同地區茶葉樣品同位素δ值平均值與標準偏差Table 2 Mean values and standard deviations of isotope ratios oftea samples fromdifferent regions in Shandong

注：不同小寫字母表示經單因素方差分析，樣本間存在顯著差異(P<0.05)。下同。
Note: Different lowercases represent that significance exists between inter-samples after one-way ANOVA(P< 0.05). The same as following.

注：A：嶗山； B： 膠南； C：日照； D：臨沂-泰安地區。Note: A: Laoshan. B: Jiaonan. C: Rizhao. D: Linyi & Taian region.圖2 各地茶葉中δ2H 和δ18O相關線性分析圖Fig.2 The relevance analysis of δ2H and δ18O of tea samples

2.2 山東不同產地茶葉礦物元素特征

茶葉中礦物元素受種植環境和施肥的影響，呈現一定的地域特性。針對山東產地茶葉中22種礦物元素特征進行測定并結合單因素方差分析，結果如表3所示。

根據元素含量，可大致分為痕量(<1 mg·kg-1)、微量(1～100 mg·kg-1)和常量(>100 mg·kg-1)元素3類，其中，痕量礦物元素有7種(Be、Cd、Cs、Ⅴ、Li、Co、Mo)，微量礦物元素有7種(Ga、Cr、Ni、Cu、Ba、Rb、Zn)，常量礦物元素有6種(Al、Fe、Ca、Mg、Mn、K)。此外，2個Pb同位素比(206Pb/207Pb、208Pb/206Pb)在各地的均值為1.1 ～2.1，鉛(Pb)同位素作為重要的地質示蹤指標，其在農產品中表現特征與地質環境密切相關[26-27]。痕量礦物元素中，嶗山茶葉中Be和Cd元素顯著高于日照，Cd雖是有毒元素，但其含量低于國家規定茶葉中的限值(1 mg·kg-1)[28]，對人體健康的影響可忽略；膠南茶葉中的Li元素含量與其他產地呈現顯著差異。微量礦物元素中，各地差異情況不同；Cr元素含量在日照與臨沂-泰安地區出現顯著差異，Ni元素含量則表現在日照、臨沂-泰安地區與嶗山茶葉不同，Cu元素含量在青島地區顯著高于日照地區，且其在日照、臨沂-泰安地區的偏差較大；Ba元素含量在臨沂-泰安地區顯著高于其他3個地區；Zn元素含量在日照和膠南地區表現出差異性。常量礦物元素中，嶗山茶葉中的Fe和K元素含量顯著高于臨沂-泰安地區，Ca元素含量顯著高于日照地區，而Mg元素含量顯著低于膠南地區。206Pb/207Pb和208Pb/206Pb表現為臨沂-泰安地區顯著高于其他3個地區。綜上所述，嶗山產區茶葉中的某幾種元素與其他一兩個產地具有顯著差異，但未有一個元素含量與其他3個產地茶葉都具有差異性；臨沂-泰安地區處于沿海內陸，該產地與其他產地具有較大差異性,呈現空間分布上的差異特征。

2.3 山東不同產地茶葉產地計量學判別分析

PLS-DA是基于PLS回歸的一種判別方式，主要反映預測變量和因變量之間的線性關系，是一種有監督的分類方法[29-30]。本研究采用4個同位素比值(δ值)與22個元素含量或元素同位素比率作為量測變量，對137份茶葉樣品進行多元統計判別分析。為降低地理尺度相近對變量的影響，采用PLS-DA對日照、嶗山茶葉分別與其他地區茶葉進行建模判別，以提高模型的分辨力。圖3能夠直觀反映出樣本間的相同與差異性，圖3-A、B中樣本基本都在95%Hotelling′s T2置信范圍內，因此，模型建立的可信度較高。圖3-C、D分別表示嶗山和日照茶葉判別模型中各變量對第1潛變量重要性(variable important for the projection, VIP)，可量化每個量測變量對判別的貢獻，VIP值越大(>1)，對產地判別的差異性越顯著[29]。在嶗山茶葉模型中共得出6個潛變量，擬合參數R2X為0.555，Q2為0.257；圖3-A中黑色圖標代表嶗山地區的茶葉樣本，灰色圖標代表日照、膠南和泰安-臨沂地區的茶葉樣本，嶗山茶葉基本能與山東其他產地進行區分；圖3-C中有6個量測變量(206Pb/207Pb、Cd、Be、K、Co和Ni)的VIP值>1，說明以上變量在嶗山茶葉與其他產地中的茶葉差異較為顯著。在日照茶葉模型中共得出3個潛在變量，擬合參數R2X為0.341，Q2為0.563；圖3-B中黑色圖標代表日照地區的茶葉樣本，灰色圖標代表嶗山、膠南和泰安-臨沂地區的茶葉樣本，可知日照茶葉與山東其他產地能有效區分；圖3-D中有8個量測變量(206Pb/207Pb、Cu、Ca、Ga、Cd、Zn、Ba和208Pb/206Pb)的VIP值>1，說明以上變量在日照茶葉與其他產地中的茶葉差異達到了顯著水平。

表3 山東不同地區茶葉樣品礦物元素含量或同位素比值Table 3 Content of mineral elements and stable isotope ratio in tea samples fromdifferent regions in Shandong

注：表中數值為平均值±標準偏差。
Note: The value in the table means average value ± standard deviation.

進一步將訓練集的137份樣品作為驗證集樣品回驗模型識別準確度，結果如表4所示。嶗山茶葉模型中，嶗山茶葉準確度為89.7%，其他產地茶葉的準確度為100%，總體準確度達97.8%；日照茶葉模型中，日照茶葉準確度為92.6%，其他產地茶葉的準確度為100%，總體準確度達96.4%。2個模型中其他產地茶葉的準確度為100%，表明模型的準確度較高。

注：A和 B分別為嶗山與日照茶葉模型的三維空間投影坐標圖；C和D分別為嶗山與日照茶葉模型的第1潛變量重要性因子圖。Note: A, B are for Laoshan and Rizhao tea model of projection, respectively. C and D are for Laoshan and Rizhao tea model of 1st VIP, repectively.圖3 嶗山與日照茶葉模型PLS-DA分析圖Fig.3 PLS-DA model analysis for Laoshan and Rizhao tea samples

表4 嶗山與日照茶葉PLS-DA模型判別分析結果Table 4 The OPLS-DA model statistical results for Laoshan and Rizhao tea samples

3 討論

茶樹屬于典型的C3植物，在光合作用過程中參與反應的葉綠體只存在于葉肉細胞中，即光合作用的產物——碳水化合物(糖類)在葉片中生成并儲存，從而能進一步被運送到莖稈合成植物自身所需的營養物質。碳水化合物中的碳、氧元素均來自二氧化碳，氫來自水。本研究結果表明，各地茶葉中δ13C值差異均未達到顯著水平，δ18O與δ2H值雖差異不顯著，但出現了一定的變化規律，即沿海地區高于沿海內陸地區，且δ18O與δ2H值呈現一定的線性相關性。光合作用過程中，攝取的氫參與合成有機物會發生一系列生物化學反應使得δ2H發生明顯同位素分餾效應[31]，但本研究中，從空間分布看，各地茶葉中δ2H與降水穩定同位素(大陸效應)變化一致。此外，各地茶葉中δ18O值變化規律與降水穩定同位素變化一致，這與光合作用對氧同位素分餾密切相關。CO2作為光合作用重要的反應物質，首先經氣孔向葉內擴散，部分被固定的CO2在與水反應生成葡萄糖的過程中，氧原子會在碳酸酐酶的催化下迅速與葉片水中的氧進行同位素交換，發生δ18O分餾，從而獲得葉片水同位素信號。前人在研究大氣降水與植物葉片水中發現，δ18O與δ2H值有較好的線性關系[32-33]，本研究發現沿海地區茶葉中δ18O與δ2H值也呈現一定的線性關系，且隨著向內陸地區的深入，兩者相關性下降。植物中的氮主要靠吸收土壤中的氮元素，在吸收、利用和同化NO3-和NH4+等無機鹽的過程中會發生不同程度的氮同位素分餾，同時δ15N值也與施肥種類有關(化肥或有機肥)。袁玉偉等[19, 34]指出有機-化肥配施比例會影響黃瓜與大白菜葉片中δ15N值，并且可以通過該值判定植物在生長過程中是否使用化肥。日本研究學者[2]指出判定茶葉使用過化肥的δ15N閾值應在5‰左右；馮海強等[35]認為如果茶葉中δ15N值在7‰以下，則大多使用了化肥氮肥。本研究結果表明，嶗山茶葉中δ15N與其他地區的差異達到了顯著水平，因此使用化肥氮肥的可能性也較大。

植物中礦物元素主要從土壤礦物質中獲得，土壤酸堿性會影響土壤中的化學反應，如土壤pH值過低或過高，常會使土壤元素有效性發生變化，從而導致不同產地的土壤中元素含量出現差異[7]。茶樹屬喜酸植物，酸性土壤是茶樹生長所必需的生態條件之一。嶗山、膠南和日照茶葉種植地區依山傍海，地貌為低山丘陵區，氣候屬溫帶季風區，地質特征主要以中酸性侵入體為基巖，巖石類型主要為花崗巖，種植土壤為棕壤土，土層較薄[4-5,21]，土壤pH值呈弱酸性，適合茶樹生長。泰安-臨沂地區地處山東省中部，冬季低溫干燥、降水量較其他產地少，具有高山氣候的自然條件，是茶樹種植的次種植區[36]。因此,根據數據分析結果，沿海三地的差別可能與土壤中有機質差異、人類活動相關。

通過穩定同位素比值和各礦物元素含量或同位素比共計26個變量，分別對嶗山與日照茶葉PLS-DA建立模型，驗證模型中總體準確率為97.8%(嶗山模型)和96.4%(日照模型)。利用該方法和模型對嶗山綠茶和日照綠茶進行有效鑒別，為保護地理尺度范圍較小的地理標志產品和產地溯源提供了方法學參考。同時，該模型可引入更多變量，有助于提高模型的穩定性和準確性，如氣象因子等[37]。

4 結論

為挖掘山東不同產地茶葉同位素比值和礦物元素含量特征，有效區分小尺度范圍產地的茶葉，利用化學計量學方法分別對日照綠茶和嶗山綠茶進行建模分析。通過單因素方差分析，對山東多產地茶葉中δ13C、δ2H、δ18O 4種穩定同位素比值以及δ15N和22種礦物元素含量或同位素比進行特征機理探討。結果顯示，山東茶葉中δ13C值差異較小，δ2H、δ18O值表現出沿海地區高于沿海內陸地區的規律，且δ18O與δ2H值呈線性相關性；嶗山產地的δ15N值較大，且與其他產地呈顯著差異。臨沂-泰安產地與嶗山、膠南和日照三地地質條件不同，使得茶葉中某些礦物元素出現空間分布上的差異特征。采用PLS-DA模型有效鑒別了嶗山綠茶與日照綠茶山東地理標志保護產品，該法對地理尺度更小的產品識別提供了研究思路。