耳蝸螺旋動脈上連接蛋白43與老年性耳聾的關系研究

司超 ，張治平 ，范志茹 ，張亮 ，李麗 ，司軍強 ，李新芝 ，馬克濤 *

老年性耳聾是指隨著年齡的增長而緩慢出現聽力閾值增加的疾病［1-3］。耳蝸螺旋動脈（SMA）是供應耳蝸血液循環系統的唯一動脈［4］。研究發現，耳蝸血流量減少、機體缺氧和炎性反應，與老年性耳聾的聽力損傷關系密切［5］。SMA上相鄰的細胞間存在大量的縫隙連接通道，細胞間的通訊依賴于縫隙連接［6-7］，連接蛋白（Cx）是構成縫隙連接的基本單位，在血管壁上Cx43的表達尤為豐富［8-9］。AAP10為縫隙連接的激動劑，可以增強縫隙連接的功能及表達。研究證明，耳蝸外側壁螺旋韌帶上Cx26、Cx30表達下調可導致耳蝸內電位減少和聽力損失［10］，而SMA上Cx43隨年齡變化的特點尚不清楚。因此，本實驗通過研究D-半乳糖（D-gal）致豚鼠和原代平滑肌細胞衰老情況下SMA上Cx43的表達變化，探討Cx43在老年性耳聾中可能發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及研究時間 無耳疾3月齡SPF級豚鼠36只，雌雄不拘，購自新疆醫科大學動物實驗中心，動物使用許可證批號：CXK New（2003-0001）。所有豚鼠低噪音環境下常規飼養，溫度20 ℃，濕度45 %。飼養及實驗過程嚴格按照《石河子大學醫學倫理委員會條例》進行。研究時間為2018年5月。

1.2 主要試劑及儀器 D-gal、牛血清白蛋白（BSA）（美國Sigma公司）；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；DMED/F-12培養基、胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）；DAPI溶液（北京索萊寶科技有限公司）；小鼠單克隆Cx43抗體、平滑肌肌動蛋白（α-SM-actin）抗體（美國Abcam公司）；Connexin 43 FITC標記二抗（北京聯科生物公司）；AAP10（杭州中肽生化有限公司）、RNeasy Mini Kit試劑盒（德國 QIAGEN 公司）；β-actin一抗、二抗（北京中杉金橋公司）；激光共聚焦顯微鏡（LSM510，德國Carl Zeiss公司）、CFX96Touch熒光定量PCR檢測系統（Bio-Rad美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 豚鼠衰老模型的制備 將豚鼠隨機分為Control組、NS組及D-gal組，每組12只。D-gal組在正常飼養的基礎上，頸背部皮下注射D-gal 500 mg·kg-1·d-1；NS組在正常飼養的基礎上，頸背部皮下注射0.9%氯化鈉溶液（體積等同D-gal組）；Control組正常飼養，不做任何處理；共6周。

1.3.2 原代SMA血管平滑肌細胞（VSMCs）培養 取Control組豚鼠交配產下的新生豚鼠3只，麻醉后脫頸處死，無菌條件下迅速分離SMA，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，于EP管中剪成4 mm左右的小塊，滴入少量含20% FBS的DMEM/F-12培養基后，均勻置于培養皿底部，將培養皿倒扣于培養箱內，2 h后將培養皿翻轉并加入含20% FBS的DMEM/F-12培養基3 ml，培養箱內靜置3 d，3 d后進行換液，6 d后可見細胞自組織塊邊緣處長出，細胞呈梭形，并呈“谷-峰狀”分布，待細胞長滿培養皿底的90%后，進行傳代。

1.3.3 細胞衰老模型制備 取第3代原代培養的SMA VSMCs進行細胞衰老模型的制備。對照組為正常培養48 h；衰老組為在正常培養基礎上加入30 g/L D-gal培養48 h；AAP10組為在正常培養基礎上加入100 nmol/L AAP10預處理，而后加入30 g/L D-gal培養48 h；收集各組細胞置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.4 Morris水迷宮測試實驗 圓形水池均分為4個象限，灌入適量清水后將圓柱平臺置于第三象限中心處。豚鼠于平臺對側象限放入池內，每次60 s或當其找到平臺時訓練結束（60 s內），2次/d，共訓練 5 d。每只豚鼠找到平臺的時間即為逃避潛伏期（若在60 s內未找到平臺，則記為60 s）。第6天時移去平臺，記錄60 s內豚鼠穿越平臺的次數。

1.3.5 聽性腦干反應（ABR）檢測 采用2%戊巴比妥鈉將豚鼠麻醉后置于測試室內，銀質電極分別置于其頂部、雙側耳乳突部及鼻尖。短聲刺激雙耳并記錄閾值，刺激由70 dB nHL開始遞減，掃描時間10 μs，疊加次數1 024，刺激間隔11.10次/s，測得閾值時停止檢測。觀察各組豚鼠ABR閾值的變化。

1.3.6 超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平檢測 各組豚鼠麻醉后，心臟采血，離心法分離血清備用。采血后處死豚鼠，迅速分離肝組織、腦組織和SMA，置于-80 ℃冰箱保存備用；按照SOD、MDA檢測試劑盒說明書進行相關檢測。計算各組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性、MDA水平，以及各組VSMCs內SOD活性、MDA水平。

1.3.7 qRT-PCR法檢測各組豚鼠SMA上Cx43 mRNA表達水平 取各組豚鼠SMA，采用RNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，經70 ℃預變性5 min，42 ℃退火60 min，4 ℃延伸5 min反轉錄為cDNA后，擴增目的基因和內參。Cx43：上游引物5'-GCTCCACTCTCGCTATGTC-3'，下游引物：5'-TAGTTCGCCCAGTTTTGCTC-3'，長度1 1 3 b p；β-a c t i n：上游引物5'-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3'， 下游引物5'-AGCCACCAATCCACACAGAG-3'， 長 度 163 bp；qRT-PCR反應條件為：95 ℃預變性 2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，循環 40 次。采用2-ΔΔCt法對數據進行統計分析。

1.3.8 Western blotting法檢測豚鼠SMA上Cx43表達水平 收集各組豚鼠SMA置于EP管中剪碎，加入蛋白裂解液充分裂解，離心后取上清液，BCA法測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸變性。經電泳、轉膜、封閉后，依次孵育β-actin一抗、Cx43一抗（1∶1 000）、二抗（1∶20 000）。暗室中曝光，采集圖像后進行分析。

1.3.9 免疫熒光技術鑒定原代VSMCs細胞、觀察Cx43表達和分布情況 取第三代細胞進行爬片和干預，經固定、透化、封閉后，分別加入α-SM-actin一抗和Cx43一抗過夜。次日加入熒光二抗和DAPI溶液染核后封片，應用激光共聚焦顯微鏡采像。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，Graphpad Prism 6.01軟件繪制圖表。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；多組間不同時間點比較采用多因素重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組豚鼠測試第1、2、3、4、5天逃避潛伏期比較 組別與時間在逃避潛伏期中存在交互作用（F交互=6.99，P交互＜0.05）；組別與時間在逃避潛伏期中主效應顯著（F組間=53.43，F時間=38.15；P組間＜0.05，P時間＜0.05）。三組豚鼠測試第1、2天逃避潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。三組豚鼠測試第3、4、5天逃避潛伏期比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中D-gal組豚鼠測試第3、4、5天逃避潛伏期長于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Control組和NS組豚鼠測試第3、4、5天逃避潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖1）。

2.2 三組豚鼠測試第6天穿越平臺次數比較 三組豚鼠測試第6天穿越平臺次數比較，差異有統計學意義（F=26.71，P＜0.01）；其中D-gal組豚鼠測試第6天穿越平臺次數少于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Control組和NS組豚鼠測試第6天穿越平臺次數比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖2）。2.3 三組豚鼠ABR閾值比較 三組豚鼠ABR閾值比較，差異有統計學意義（F=35.31，P＜0.01）；其中D-gal組豚鼠ABR閾值高于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；Control組和NS組豚鼠ABR閾值比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖3）。

圖1 三組豚鼠測試第1、2、3、4、5天逃避潛伏期比較Figure 1 Comparison of the escape latency in three groups on day 1，2，3，4 and 5

圖2 三組豚鼠測試第6天穿越平臺次數比較Figure 2 Comparison of the number of times of crossing the platform in three groups on day 6

圖3 三組豚鼠ABR閾值比較Figure 3 Comparison of ABR threshold in three groups

2.4 三組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性、MDA水平比較 三組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性比較，差異有統計學意義（F肝組織=52.94，P肝組織＜0.01；F腦組織=148.40，P腦組織＜0.01；F血清=115.60，P血清＜0.01）；其中D-gal組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性低于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；Control組和NS組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖4）。

三組豚鼠肝組織、腦組織、血清MDA水平比較，差異有統計學意義（F肝組織=116.10，P肝組織＜0.01；F腦組織=26.43，P腦組織＜0.01；F血清=52.53，P血清＜0.01）；其中D-gal組豚鼠肝組織、腦組織、血清MDA水平高于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；Control組和NS組豚鼠肝組織、腦組織、血清MDA水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖5）。

2.5 對照組、衰老組、AAP10組VSMCs內SOD活性、MDA水平比較 對照組、衰老組、AAP10組VSMCs內SOD活性、MDA水平比較，差異有統計學意義（FSOD=64.19，P＜0.01；FMDA=80.42，P＜0.01）； 其 中衰老組VSMCs內SOD活性低于對照組和AAP10組，MDA水平高于對照組和AAP10組，差異有統計學意義（P＜0.01）；AAP10組VSMCs內SOD活性低于對照組，MDA水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01，見圖6）。

圖6 對照組、衰老組和AAP10組細胞VSMCs內SOD活性、MDA水平比較Figure 6 Comparison of SOD activity and MDA level in VSMCs in three groups

圖4 三組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性Figure 4 SOD activity of liver tissue，brain tissue and serum in three groups

圖5 三組豚鼠肝組織、腦組織、血清MDA水平Figure 5 MDA level of liver tissue，brain tissue and serum in three groups

2.6 三組豚鼠SMA上Cx43 mRNA表達水平 三組豚鼠SMA上Cx43 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（F=221.40，P＜0.01）；D-gal組 豚 鼠 SMA上 Cx43 mRNA表達水平低于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；Control組和NS組豚鼠SMA上Cx43 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖7）。

圖7 三組豚鼠SMA上Cx43 mRNA表達水平Figure 7 Expression of Cx43 mRNA on SMA in three groups

2.7 三組豚鼠SMA上Cx43蛋白表達水平比較 三組豚鼠SMA上Cx43蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（F=221.40，P＜0.01）；其中 D-gal組豚鼠SMA上Cx43蛋白表達水平低于Control組和NS組，差異有統計學意義（P＜0.01）；Control組和NS組豚鼠SMA上Cx43 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見圖 8～9）。

2.8 原代VSMCs鑒定及對照組、衰老組、AAP10組VSMCs中Cx43表達水平比較 細胞免疫熒光結果顯示，在原代培養的細胞中，VSMCs特異性表達的肌動蛋白（α-SM-actin，即綠色熒光），陽性表達率達90%以上（見圖10）。對照組、衰老組、AAP10組VSMCs中Cx43表達水平比較，差異有統計學意義（F=477.60，P＜0.01）；其中衰老組VSMCs中Cx43表達水平低于對照組和AAP10組，差異有統計學意義（P＜0.05）；AAP10組VSMCs中Cx43表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖11～12）。

圖8 三組豚鼠SMA上Cx43表達電泳圖Figure 8 Electrophoresis pattern of Cx43 expression on SMA in three groups

圖9 三組豚鼠SMA上Cx43表達水平Figure 9 Expression of Cx43 on SMA in three groups

圖10 原代平滑肌細胞免疫熒光染色圖（×200）Figure 10 Immunofluorescence staining of primary smooth muscle cells

圖12 對照組、衰老組、AAP10組VSMCs中Cx43表達水平比較Figure 12 Comparison of Cx43 expression in VSMCs among the control group，aged group and AAP10 group

3 討論

目前制備衰老模型的主要方法有D-gal給藥法［11］、快速老化小鼠［12］等，其中D-gal給藥法因為其成模耗時短、價格低廉和結果穩定的優點，已被廣泛應用于國內外相關研究［13-15］，其主要的機制是短時間內大量注射D-gal，使細胞內半乳糖含量增高，半乳糖在體內被還原成無法通過細胞膜進行代謝的半乳糖醇，從而在細胞內聚集，影響細胞滲透壓，導致組織腫脹、功能障礙、代謝異常，最終機體發生衰老［11，16］；此外，D-gal在機體作用下產生O2-和H2O2等大量活性氧，導致SOD活性下降和MDA水平升高，進而引起機體老化［17-18］。本實驗Morris水迷宮行為測試顯示，D-gal組豚鼠測試第3、4、5天逃避潛伏期長于Control組和NS組，D-gal組豚鼠測試第6天穿越平臺次數少于Control組和NS組；表明D-gal組豚鼠腦功能下降，而Control組和NS組均無明顯變化，說明D-gal組豚鼠體內自由基含量增加，引起豚鼠機體老化，衰老模型制備成功。D-gal造模完成后，D-gal組豚鼠肝組織、腦組織、血清SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高。有研究顯示，在CBA小鼠和FBN大鼠衰老模型中，ABR閾值隨年齡增長而升高［19-20］。本實驗對各組豚鼠ABR閾值檢測結果分析發現，D-gal組豚鼠ABR閾值較Control組和NS組明顯升高，提示D-gal組豚鼠出現老年性耳聾。

耳蝸的血液供應來自SMA，SMA功能的下降與耳蝸側壁血管紋損傷、耳蝸微循環缺血及聲音信號傳導障礙有著密切的聯系［21］。SMA由內皮細胞和平滑肌細胞組成，細胞間存在大量的縫隙連接，縫隙連接的存在對血管收縮和舒張功能至關重要［22］。有研究證明，血管是人體最先衰老的組織，主要表現為動脈彈性降低、結構重塑等［23-25］。

縫隙連接是一種細胞與細胞間的連接形式，由Cx組成，在機體內廣泛表達，耳蝸內螺旋韌帶上主要表達 Cx26、Cx30［10］，血管壁上主要表達 Cx37、Cx40、Cx43 及 Cx45［8-9，26］。耳蝸外側壁螺旋韌帶上 Cx26、Cx30表達下調可導致耳蝸內電位減少和聽力損失［10］；特異性敲除Cx37和Cx40將造成全身多器官的血管畸形［27］；血管平滑肌細胞發生增殖時Cx43表達上升，抑制Cx43的表達可以限制新生內膜的過度增生［28］，說明縫隙連接在維持正常聽力和血管正常功能上有重要意義，但Cx43與年齡相關的聽力損失的關系尚不清楚。本實驗利用免疫熒光技術和qRT-PCR、Western blotting法對各組豚鼠SMA和原代VSMCs上Cx43表達水平進行檢測，結果表明，D-gal組豚鼠SMA上Cx43 mRNA及Cx43表達水平均較Control組和NS組下降。衰老組VSMCs中Cx43表達水平低于對照組和AAP10組，AAP10組VSMCs中Cx43表達水平低于對照組，表明原代VSMCs經D-gal干預后，Cx43蛋白熒光強度較對照組降低，給予縫隙連接激動劑AAP10預處理后再給予D-gal干預可上調Cx43的表達。

綜上所述，本實驗發現在D-gal致衰老的情況下，豚鼠SMA上Cx43表達的變化可能與老年性耳聾有關，但是其具體的作用機制尚不清楚需進一步研究，這為臨床后續的研究方向奠定了基礎，也為老年性耳聾的預防和診治提供了新的方向。

注：連接蛋白=Cx；DAPI為細胞核DAPI染色（藍色熒光）；Merge為Cx43在VSMCs的表達與細胞核DAPI染色的重疊