不同時機電針阿是穴對腓腸肌鈍挫傷大鼠腓腸肌高頻超聲成像評分和血清肌酸激酶的影響研究

朱世鵬，袁亞，劉通，張朝暉，葉新華，周靜珠，陳歡*，張前德

骨骼肌鈍挫傷損傷是日常生活及體育活動中最常見的軟組織損傷形式之一，疼痛、腫脹、功能障礙等并發癥可嚴重影響患者的生活質量。現代研究認為骨骼肌損傷的早期（炎癥期）應以制動為主，一些針對局部組織的治療方法如果過早干預可能會帶來新的損傷，例如拉伸訓練、高壓氧等治療［1-2］。然而，制動時間過長或者有效治療措施不及時介入，也會妨礙肌纖維再生，出現組織纖維化，影響組織修復。因此，探討各種有效治療方法的介入時機有重要意義。

阿是穴是針灸治療骨骼肌損傷的常用穴位。本課題組前期研究發現，骨骼肌損傷后24 h開始進行連續的電針阿是穴治療可通過上調一些細胞生長因子〔如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血管內皮生長因子（VEGF）〕的表達進而促進肌衛星細胞的增殖、分化［3-6］。鈍挫傷后24 h正處于機體炎性反應的高峰期，電針阿是穴作為一種局部刺激，在其發揮治療作用的同時，可能還伴有局部的輕微損傷，甚至加重炎性反應。而鈍挫傷后72 h（3 d）炎性反應逐漸消退，病灶組織進入再生修復期，若在這個時期再行治療，是否更有利于或不利于針刺作用的發揮，目前尚未有研究證據。本課題組推測在損傷后的不同時期進行電針阿是穴治療，可能對組織修復產生差異效應。

骨骼肌鈍挫傷后，組織的修復程度難以通過病灶皮表形態做出準確評估。高頻超聲作為一種無創、價廉的技術，可以動態觀察肌肉細小結構的組織形態，目前被逐漸應用于肌肉骨骼疾病的診斷中［7］。本課題組前期研究結果顯示，高頻超聲技術可呈現大鼠腓腸肌鈍挫傷后的動態影像變化，可以評估組織修復程度［8］。因此，為了解電針阿是穴對骨骼肌鈍挫傷的最佳干預時機，本研究比較損傷后24 h與72 h電針阿是穴對大鼠腓腸肌鈍挫傷后高頻超聲成像、組織形態以及血清肌酸激酶（CK）的時序性影響，以初步探討腓腸肌鈍挫傷后電針阿是穴的最佳介入時機，為制定科學的針灸治療方案提供依據。

本研究創新性：

本研究首次采用高頻超聲成像技術對電針阿是穴對大鼠腓腸肌鈍挫傷的療效進行量化評估，同時還比較了損傷后不同時機電針阿是穴的效應差異。臨床上，運動員在訓練過程中極易發生骨骼肌的暴力性鈍挫傷，本課題組的研究結果可為此類骨骼肌損傷形式診療方案的制定提供一定科學依據。

本研究不足：

（1）研究中電針阿是穴僅進行一次治療，未能對阿是穴的連續性累積效應進行觀察。（2）本研究并未對損傷后24 h這一時間點進行各指標的觀察，因此，無法明確電針阿是穴在損傷較早期的干預效應。今后還需進一步研究。

1 材料與方法

1.1 研究時間 2017年9月。

1.2 實驗動物及分組 清潔級健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠60只，平均體質量（250±20）g，購自南京醫科大學醫藥實驗動物中心。將大鼠隨機分為空白組（n=6）、模型組（n=18）、24 h電針組（n=18）、72 h電針組（n=18）。大鼠置于清潔柜中，自由攝食與飲水，溫度（20±1）℃，濕度保持在50%左右，每日保持12 h的固定明暗周期，適應性喂養1周后開始實驗。動物的使用符合南京醫科大學實驗動物福利倫理委員會要求（倫理編號：IACUC-1709007）。

1.3 主要儀器與試劑 VINNO8便攜超聲儀、X9-22L線陣探頭（蘇州飛依諾公司）；NT6021電針治療儀（北京瑞德埃克森醫療投資有限公司）；HM340E石蠟切片機（美國thermo fisher scientific公司）；組織芯片掃描儀（Pannoramic MIDI，3D HISTECH，Ltd，Hungary）；10%水合氯醛溶液（國藥集團化學試劑有限公司）；CK試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.4 方法

1.4.1 造模方法 模型組、24 h電針組、72 h電針組均參照本課題組前期研究的方法建立腓腸肌急性鈍挫傷模型［3］。用10%水合氯醛溶液進行腹腔內注射麻醉，剪除大鼠雙下肢腓腸肌處被毛。大鼠俯臥位并保持踝關節跖曲90°，使腓腸肌位于脛腓骨內側。腓腸肌肌腹中點做標記，采用骨骼肌鈍挫傷打擊器擊打大鼠腓腸肌1次，打擊器總質量為500 g，由33 cm處自由落體，打擊器與腓腸肌接觸面積約為1 cm2，觀察擊打部位，表皮無破損，有散在紅色斑點，皮下暗紅。

1.4.2 超聲檢查 分別在造模前及造模后3 h、3 d、5 d、7 d進行超聲檢查，檢查時用10%水合氯醛溶液按0.35 ml/100 g的注射量進行腹腔內注射麻醉。檢查時采用與造模時相同的體位，大鼠俯臥在平坦的桌面上，后肢伸展，厚涂耦合劑，采用VINNO8便攜超聲儀、X9-22L線陣探頭，觀察腓腸肌的超聲圖像，采用鈍挫傷損傷程度的超聲分級評分表（見表1）對損傷肌肉進行評分［8-9］。上述操作由同1名診斷經驗豐富的超聲醫師完成，超聲醫師對分組情況不了解。

1.4.3 電針方法 由于動物無言語表達能力，研究中阿是穴的選取以局部病灶（即腓腸肌肌腹的中點，輔以超聲進行病灶定位）作為針刺部位。電針頻率為2/10 Hz的疏密波，電流強度1～2 mA，持續30 min［3］。除空白組外，各組造模后3、5、7 d分別抓取不同的6只大鼠進行以下操作：其中24 h電針組在鈍挫傷后24 h進行1次針刺治療，72 h電針組在鈍挫傷后72 h進行1次針刺治療。模型組與2個電針組同步抓取與固定，但不做電針干預。空白組不做任何處理，同步取材。

1.4.4 取材 各組大鼠分別在造模后3、5、7 d取材。10%水合氯醛溶液進行腹腔內注射麻醉，開腹鈍性分離出腹主動脈，取5 ml動脈血，在室溫靜置2 h，4 ℃下3 500 r/min 離心10 min（離心半徑13.5 cm），將上層血清轉移至-20 ℃冰箱保存。再采取脊椎脫臼法處死大鼠，暴露分離出左腿腓腸肌，取腓腸肌肌腹中段病灶組織約1 cm3，0.9%氯化鈉溶液沖洗，后置于10%甲醛溶液固定滿意后行石蠟包埋。

表1 鈍挫傷損傷程度超聲分級評分表Table 1 Ultrasound-based gastrocnemius contusion injury severity rating scale

1.4.5 HE染色 10%甲醛溶液固定滿意后，清水沖洗，常規梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）脫水，石蠟包埋，連續切片，制成6 μm左右的切片，二甲苯脫蠟，經各級乙醇梯度（70%、80%、90%、95%、100%）至水洗。蘇木素染色5 min，自來水沖洗；鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，脫水、透明，樹膠加蓋玻片封固。光鏡下觀察組織結構變化。

1.4.6 血清CK水平檢測 取凍存的血清，參照CK試劑盒說明書檢測血清CK水平。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腓腸肌超聲影像時序性表現 各時間點大鼠腓腸肌超聲圖像見圖1。造模前大鼠腓腸肌（紅色線圈所示）形態飽滿，肌纖維結構清晰可見，未見明顯液性暗區（見圖1A）。造模后3 h大鼠腓腸肌肌肉明顯腫脹，局部可見血腫形成，呈低回聲（紅色箭頭），肌纖維斷裂（白色箭頭），肌肉結構破壞，模糊不清（黃色箭頭）（見圖1B）。

造模后3 d，模型組大鼠腓腸肌仍有輕度腫脹，肌纖維不連續，局部肌肉結構顯示欠清晰，血腫較前吸收（見圖1C）。造模后5 d，模型組大鼠腓腸肌肌肉腫脹不明顯，肌纖維不連續，肌肉結構完整，血腫多已吸收，可見點狀強回聲（見圖1D）。造模后7 d，模型組大鼠腓腸肌肌纖維欠連續，局部尚不清晰（圖1E）。

造模后3 d，24 h電針組腓腸肌液性暗區較模型組明顯減少，肌纖維仍然不連續，可見點狀強回聲（見圖1F）。造模后5 d，24 h電針組肌纖維比較連續，肌肉結構較完整（見圖1G）。造模后7 d，24 h電針組肌纖維比較連續，局部較清晰，但肌纖維結構仍未恢復至正常（見圖1H）。

造模后3 d，72 h電針組與模型組比較無明顯差異，可見少數細小的液性暗區（見圖1I）。造模后5 d，72 h電針組肌纖維仍不連續，但較模型組好轉（見圖1J）。造模后7 d，72 h電針組肌纖維較連續，少數肌肉結構欠清晰（見圖1K）。

注：A為造模前，B為造模后，C、D、E為模型組，F、G、H為24 h電針組，I、J、K為72 h電針組

2.2 各組大鼠造模后不同時間點鈍挫傷損傷程度的超聲分級評分表評分比較 各組大鼠造模后即刻超聲分級評分表評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠造模后不同時間點干預后超聲分級評分表評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后3 d，24 h電針組造模后即刻超聲分級評分表評分與干預后超聲分級評分表評分差值大于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）； 造模后3 d，72 h電針組大鼠不同時間點造模后即刻超聲分級評分表評分與干預后超聲分級評分表評分差值小于24 h電針組，差異有統計學意義（P＜0.05）；各組大鼠造模后5d、7d造模后即刻超聲分級評分表評分與干預后超聲分級評分表評分差值比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

2.3 各組大鼠腓腸肌病理形態改變 空白組肌細胞規則，排列整齊，肌纖維間隙大小一致（見圖2A～B）。

模型組造模后3 d肌纖維排列不整齊，可見炎性細胞浸潤（黑色箭頭所示），組織細胞間隙增大、水腫（見圖2C）；造模后5 d炎性細胞明顯減少，肌細胞形態不整齊，肌纖維斷裂，可見少量細胞核位于中間的新生肌細胞（紅色箭頭所示），并逐漸向病灶處匯聚（見圖2D）；造模后7 d基本無炎性細胞浸潤，肌細胞形態不規則，新生的肌纖維逐漸融合增粗（藍色箭頭所示），伴有明顯的結締組織增生（綠色箭頭所示）（見圖2E）。

表2 各組大鼠造模后不同時間點鈍挫傷損傷程度的超聲分級評分表評分比較（x±s，分）Table 2 Ultrasound-based gastrocnemius contusion injury score at different time points in each group

24 h電針組造模后3 d肌纖維不連續，明顯的炎性細胞浸潤（以單核細胞為主）（黑色箭頭所示），組織細胞間隙增大、水腫（見圖2F）；造模后5 d炎性細胞明顯減少，肌細胞形態不規則，可見較多的新生肌細胞（紅色箭頭所示）（見圖2G）；造模后7 d新生肌細胞逐漸向病灶處匯聚（藍色箭頭所示），結締組織增生較模型組減輕（綠色箭頭所示）（見圖2H）。

72 h電針組造模后3 d肌纖維不連續，明顯的炎性細胞浸潤（黑色箭頭所示），組織細胞間隙增大、水腫（見圖2I）；造模后5 d仍可見少量炎性細胞（黑色箭頭所示），同時伴有新生肌細胞（紅色箭頭所示）（見圖2J）；造模后7 d可見較明顯的新生肌細胞逐漸向病灶處匯聚（藍色箭頭所示），輕度的結締組織增生（綠色箭頭所示）（見圖2H）。

2.4 各組大鼠造模后不同時間點血清CK水平比較 4組大鼠造模后3、5、7 d血清CK水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠造模后3、5、7 d血清CK水平均高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；24 h電針組大鼠造模后5、7 d血清CK水平均高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；72 h電針組大鼠造模后3 d血清CK水平低于模型組，造模后5、7 d血清CK水平均高于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 各組大鼠損傷后不同時間點血清CK水平比較（x±s，U/ml）Table 3 Average CK level in serum at different time points in each group

3 討論

《靈樞·經筋》記載：“治在燔針劫刺，以知為數，以痛為腧”，這是最早提出的“以痛為腧”治療經筋病的觀點。唐代·孫思邈在《千金要方》中根據前人“以痛為腧”的理論，提出了阿是穴之名。隨著現代針灸學理論的發展，阿是穴的概念還包括一些組織形態結構發生改變的點或區域等［10］。由于動物對疼痛的感覺無主觀表達能力，不能描述出具體痛點位置，故在針刺研究中常取打擊的中心部位作為阿是穴進行治療。

本課題組前期研究發現［3］，大鼠腓腸肌鈍挫傷后3 d左右，病灶往往無法通過肉眼來精準判斷，因此在治療與取材過程中可能存在偏差。本研究采用了高頻超聲技術，能無創、簡便地對造模的損傷程度、病灶定位等進行評估，使研究結果更加準確。參考LEINEWEBER等［9］以及本課題組前期研究結果，在本研究中采用高頻超聲技術與超聲分級評分表評分觀察了損傷后24 h與72 h電針阿是穴對大鼠腓腸肌鈍挫傷組織的修復作用，結果顯示，損傷后3 h，各組大鼠腓腸肌超聲圖像上均顯示出肌肉結構破壞，肌纖維斷裂，局部呈低回聲的血腫形成表現，且各組大鼠造模后即刻超聲分級評分表評分結果無統計學差異，提示本研究采用的一次性鈍挫傷造模方法較好，可重復性較高。

損傷后3 d，從超聲影像上觀察到組織仍有水腫情況，肌肉邊緣分界不清，局部可見無回聲，提示為血腫。這與HE染色的病理形態學表現基本一致，病灶局部可見部分炎性細胞浸潤，組織處于炎性水腫階段，肌纖維不連續。24 h電針組超聲成像上腓腸肌液性暗區較模型組明顯減少，可見點狀強回聲，為陳舊性出血灶，提示出血灶在逐漸機化、吸收。此時，72 h電針組與模型組比較無明顯差異，但可見少數細小的液性暗區。研究中，72 h電針組在電針治療后4 h左右進行超聲檢測與取材，因此筆者推測細小的液性暗區可能與針灸治療有關，針刺過程可能造成少數較小的新鮮出血灶。本研究結果顯示，24 h電針組超聲分級評分表評分差值顯著高于模型組與72 h電針組，提示損傷后24 h電針阿是穴治療能較有效促進鈍挫傷早期出血灶、壞死組織以及水腫的吸收。從病理形態上看，24 h電針阿是穴組可見較多的單核細胞（巨噬細胞）出現。研究認為，炎性細胞（巨噬細胞、中性粒細胞）在骨骼肌損傷修復的作用就如同一把雙刃劍；在損傷早期，炎性細胞浸潤到損傷局部，尤其是巨噬細胞，可吞噬壞死肌細胞，有利于肌細胞的再生與分化［11］。此外，炎性細胞還可釋放一些促炎細胞因子、生長因子等［12］，進步一調節肌衛星細胞的再生，比如本課題組前期研究發現的bFGF、VEGF等［3-6］。隨著炎性反應的消退，當病灶組織逐漸進入再生修復期與組織重塑期，一些慢性炎性反應則不利于組織再生修復，甚至引起纖維化，影響骨骼肌功能的恢復［13］。因此，推測損傷后24 h電針治療可能通過促進炎性細胞的浸潤，加快壞死組織的吸收進而促進組織修復。

圖2 各組大鼠腓腸肌病理圖（HE染色）Figure 2 Pathological morphology of gastrocnemius muscle in each group

血清CK是骨骼肌細胞內的一種重要的代謝酶。當骨骼肌細胞受到破壞時，在血液中可檢測到CK水平升高，是骨骼肌損傷情況的重要指標之一［14］。本研究結果顯示，模型組大鼠造模后3、5、7 d血清CK水平均高于空白組，提示在損傷后7 d，大鼠骨骼肌細胞細胞膜仍未恢復正常狀態［15］。造模后3 d，72 h電針組血清CK水平均低于模型組，且與空白組比較無統計學差異，提示損傷后72 h進行1次電針治療，能有效促進血清CK水平恢復正常。因為72 h電針組血清CK水平是在電針后即刻檢測的，因此，筆者推測電針對血清CK水平的即刻調節較為明顯。這也說明，雖然超聲成像在72 h電針組觀察到小的出血灶，但其血清CK水平并未升高，提示雖然電針造成細小的出血，但并不會明顯影響電針促進機體對血清CK水平的代謝作用。

造模后5、7 d超聲分級評分表評分結果顯示，24 h電針組及72 h電針組干預后的超聲分級評分表評分低于模型組，但無統計學差異。這提示早期的電針治療可能能較早地激發炎性反應與肌衛星細胞的再生，使修復進程縮短。其中，單看數據可見24 h電針組超聲分級評分表評分與血清CK水平均低于72 h電針組，雖然無統計學差異，但筆者推測與72 h電針治療比較，24 h電針治療能更快地促進組織修復。

此外，造模后5 、7 d，24 h電針組與72 h電針組血清CK水平均高于正常組，雖然其低于模型組但均無統計學差異，但提示損傷后24 h或者72 h僅進行1次電針阿是穴治療，并不能持續下調損傷后血清CK水平的上升，可能需要通過連續性的治療來維持針灸的治療效應，今后還有待進一步研究。

綜上所述，電針阿是穴能有效促進大鼠腓腸肌鈍挫傷后的組織修復，損傷后24 h電針阿是穴治療能較早促進組織修復。