亞硒酸鈉對湯姆青霉菌核分化和抗氧化性的影響

李改平，韓建榮，杜引弟

（1.山西衛生健康職業學院，山西晉中030619；2.山西大學生命科學與技術學院，山西太原030006；3.山西省中醫學校，山西晉中030619）

抗氧化協同效應是指2 種或2 種以上的抗氧化物聯合使用，獲得高于單獨使用其中任何一種抗氧化物抗氧化性的效果。其包括：抗氧化物與抗氧化物之間的協同效應、抗氧化物與維生素之間的協同效應、抗氧化物與有機酸及其衍生物之間的協同效應和抗氧化物與微量元素之間的協同效應[1]。在機體內，硒是一種必需的微量元素，本身具有一定抗氧化性，會與VE等抗氧化物產生抗氧化協同效應[2]。PT95 和Q1 菌株菌核內可積累類胡蘿卜素和抗壞血酸等抗氧化物質，并具有一定的抗氧化性。

本試驗將在MEA 培養基中添加不同濃度的亞硒酸鈉（Na2SeO3），觀察硒對PT95 和Q1 菌株菌核分化的影響，并通過測定菌核中的類胡蘿卜素含量、抗壞血酸含量、總酚含量及其提取物的還原力、DPPH 自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力和清除超氧陰離子的能力來評價硒對PT95 和Q1 菌株菌核抗氧化性的影響；同時，采用正交試驗設計對PT95 和Q1 菌株菌核的富硒培養條件進行了優化。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 供試菌株為Penicillium thomii PT95菌株和Penicillium thomii Q1 菌株，由山西大學生命科學學院提供，查氏（CA）斜面保存。

1.1.2 培養基 麥芽汁培養基（MEA）：麥芽膏20 g，蛋白胨1.0 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：20%馬鈴薯煮汁1 000 mL，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。

1.2 試驗方法

在PDA 和MEA 培養基中添加Na2SeO3，使得培養基中Na2SeO3的濃度分別達到3，6，10 μg/mL，這些培養基作為不同的富硒生長條件，同時以沒有添加Na2SeO3的培養基作為對照。每個9 cm 培養皿倒入25 mL 培養基，凝固后用接種針挑取3 粒單菌核，用三點接種法接入培養皿中，置于黑暗條件下，25 ℃培養25 d。在培養過程中，每天觀察菌株的滲出液滲出時間、菌核出現時間以及菌核成熟時間，并做好記錄。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 菌核生物量的測定 用蒸餾水將成熟的PT95 菌核和Q1 菌核從培養基表面沖洗下來，反復沖洗5～10 次，置于50 ℃烘箱中烘干至恒質量。

1.3.2 類胡蘿卜素的提取及含量測定 按韓建榮等[3]和付榮榮等[4]的方法提取菌核中的類胡蘿卜素，按王業勤等[5]的方法計算類胡蘿卜素含量。

1.3.3 硒含量測定[6]

1.3.3.1 標準曲線繪制 分別取1.0～5.0 mL 的硒標準液（5 μg/mL）置于分液漏斗中，加入3 mL 鄰苯二胺溶液（0.1%），并用蒸餾水補至50 mL 左右，混合均勻后用甲酸（80%）和濃氨水將pH 值調至2.0，將該混合物在室溫下放于黑暗中靜置60 min，用10 mL 甲苯振蕩萃取該混合物3 min 后再靜置8 min，棄去水層，將剩余的溶液轉移至50 mL 容量瓶，并用甲苯定容，在335 nm 處比色。

1.3.3.2 菌核中硒含量測定 準確稱取2 g 菌核，加入30 mL 混合酸（V（HNO3）：V（H2SO4）＝4∶1）后蓋上表面皿，并于黑暗中冷消化24 h。將冷消化后的溶液加熱消化至澄清，冷卻后轉移至50 mL 容量瓶中，并用水定容。

式中，C 為來自標準曲線的相當于硒的標準濃度（μg/mL）；V 為從甲苯萃取得到的樣品體積（mL）；W 為樣品質量（g）；N 為用于測定的樣品體積占總定容后樣品的體積分數。

1.3.4 抗氧化性測定

1.3.4.1 提取菌核抗氧化物質 稱取干菌核1 g，加入20 mL 乙醇（80%），在50 ℃150 r/min 的搖床上提取24 h，采用濾紙過濾保留濾液。濾渣仍用20 mL乙醇（80%）重復提取，2 次濾液合并，使用80%的乙醇稀釋定容至100 mL 作為母液，濾渣烘干稱質量。

1.3.4.2 總酚含量的測定 采用Folin-Cioncalteu比色法[8-9]測定樣品總酚含量。在0.4 mL 菌核提取物稀釋液或沒食子酸稀釋液中加入2.8 mL 蒸餾水和0.2 mL Folin-Cioncalteu 試劑，混合均勻后靜置6～8 min，再加入0.6 mL 飽和Na2SeO3溶液，室溫下黑暗靜置120 min，在760 nm 處測定其OD 值。標準曲線則使用0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL 的沒食子酸稀釋液進行繪制。

1.3.4.3 DPPH 自由基清除能力的測定 DPPH 自由基清除能力的測定采用文獻[10]進行。將200 μL樣品液加入濃度為0.08 mmol/L 的DPPH（3.8 mL）中，充分搖勻后在室溫下避光靜置24 h，之后在517 nm處測定吸光度值。用提取溶劑代替樣品液作為對照。EC50值是根據吸光度和樣品液濃度來計算。

1.3.4.4 測定還原能力 用鐵氰化鉀還原法測定[11]，EC50值是依據吸光度和樣品液濃度計算。

1.3.4.5 亞鐵離子螯合能力測定 其采用文獻[12]的方法測定。將1.6 mL 樣品溶液溶于1.6 mL 蒸餾水中，然后與0.4 mL 濃度為0.5 mmol/L 的FeCl2溶液混合搖勻，然后再加入0.4 mL 濃度為1 mmol/L的菲洛嗪。劇烈搖動1 min，室溫下放置20 min，在562 nm 處測定吸光度值。以80%乙醇代替樣品作為空白，0.5 mmol/L EDTA 作為陽性對照。EC50值是根據吸光度和樣品液濃度來計算。

1.4 統計學分析

試驗設3 次重復，結果以“平均值±標準差”表示，多個均數間的兩兩比較采用Duncan 多重比較法[13]。

2 結果與分析

2.1 亞硒酸鈉對PT95 和Q1 菌株菌核分化的影響

在PDA 和MEA 培養基中添加不同濃度的Na2SeO3，結果發現，PDA 培養基表面幾乎沒有菌核形成，而MEA 培養基添加硒后比較有利于2 株菌核的分化。從表1 可以看出，在MEA 培養基中添加Na2SeO3，隨著Na2SeO3濃度的提高，2 株菌株滲出液出現的時間都延后了1～2 d，菌核出現的時間延后了3～5 d，菌核成熟的時間延后了4～6 d，且Q1 菌株菌核的分化比PT95 菌株菌核的分化普遍要快。

表1 Na2SeO3 對PT95 和Q1 菌株菌核分化的影響 d

2.2 亞硒酸鈉對PT95 和Q1 菌株菌核生物量的影響

從表2 可以看出，在添加Na2SeO3的培養基上，2 株菌株的菌核生物量與硒濃度呈顯著負相關（rPT95＝－0.901，rQ1＝－0.939）；當培養基中Na2SeO3的濃度為10 μg/mL 時，2 株菌株的菌核生物量最小，分別為0.20，0.09 mg/ 平板，是對照的0.80 倍和0.39 倍。

表2 Na2SeO3 對PT95 和Q1 菌株菌核生物量的影響 mg/平板

2.3 亞硒酸鈉對PT95 和Q1 菌株菌核類胡蘿卜素含量的影響

由圖1 可知，在添加Na2SeO3的MEA 培養基上，PT95 菌株菌核中的類胡蘿卜素含量與外源Na2SeO3濃度呈一定的正相關（r＝0.526），當培養基中Na2SeO3的質量濃度為3 μg/mL 時，類胡蘿卜素含量達到了最大（85.00 μg/g），是對照的10.76 倍；Q1 菌株菌核中的類胡蘿卜素含量與外源Na2SeO3濃度呈一定的正相關（r＝0.752），當培養基中Na2SeO3的質量濃度為10 μg/mL 時，類胡蘿卜素含量達到了最大（62.90 μg/g），是對照的5.57 倍。

2.4 亞硒酸鈉對PT95 和Q1 菌株菌核總酚含量的影響

從圖2 可以看出，湯姆青霉PT95 菌株菌核提取物中總酚含量與外源Na2SeO3濃度之間有一定的負相關性（r＝-0.367）；Q1 菌株菌核提取物中總酚含量與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的負相關性（r＝-0.908），對照的總酚含量最高，分別達到了15.59，15.15 mg/g，不同培養條件下菌核總酚含量的大小為MEA＋Na2SeO310 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL。

2.5 亞硒酸鈉對PT95 和Q1 菌株菌核抗氧化性的影響

表3 顯示，MEA 培養基上，PT95 和Q1 菌株菌核提取物還原能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有一定的負相關性（rPT95＝-0.757，rQ1＝-0.793），添加不同濃度的外源Na2SeO3后，2 個菌株菌核提取物還原能力的EC50值顯著低于對照。

表3 Na2SeO3 對PT95 和Q1 菌株菌核還原力的影響

綜上所述，當MEA 培養基中含有一定濃度的外源Na2SeO3（10 μg/mL）時，有利于2 株菌株菌核提取物還原力的提高。

從表4 可以看出，MEA 培養基上，湯姆青霉PT95 菌株菌核提取物DPPH 自由基清除能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有弱的正相關性（r＝0.239）；對照的DPPH 自由基清除能力最大（0.38 mg/mL），不同培養條件下，DPPH 自由基清除能力的大小為MEA＋Na2SeO310 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL。Q1 菌株菌核提取物DPPH 自由基清除能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有弱的負相關性（r＝-0.230）；不同培養條件下，DPPH 自由基清除能力的大小為MEA＋NaNa2SeO310 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL。

表4 Na2SeO3 對PT95 菌株和Q1 菌株DPPH自由基清除能力的影響

表4 結果表明，添加外源Na2SeO3不利于PT95菌株DPPH 自由基清除能力的提高，添加較高濃度的Na2SeO3（10 μg/mL）有利于Q1 菌株DPPH 自由基清除能力的提高，但提高的幅度不大。

從表5 可以看出，在MEA 培養基上，PT95 菌株菌核提取物亞鐵離子螯合能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的正相關性（r＝0.936）；對照的亞鐵離子螯合能力最大（0.53 mg/mL），不同培養條件下，亞鐵離子螯合能力的大小為MEA＋Na2SeO36 μg/mL＞MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO310 μg/mL。Q1 菌株菌核提取物亞鐵離子螯合能力的EC50值與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的正相關性（r＝0.954），對照的亞鐵離子螯合能力最大（0.41 mg/mL）；不同培養條件下，亞鐵離子螯合能力的大小為MEA＋Na2SeO33 μg/mL＞MEA＋Na2SeO36 μg/mL＞MEA＋Na2SeO310 μg/mL。

表5 Na2SeO3 對PT95 和Q1 菌株亞鐵離子螯合能力的影響

結果表明，添加外源Na2SeO3不利于2 株菌株亞鐵離子螯合能力的提高。

2.6 亞硒酸鈉對PT95 和Q1 菌株菌核硒含量的影響

從圖3 可以看出，在MEA 培養基上，PT95 菌株菌核的硒含量與外源Na2SeO3濃度之間有顯著的正相關性（r＝0.940），并在Na2SeO3的質量濃度為10 μg/mL 時達到最大（6.09 μg/g）；Q1 菌株菌核的硒含量與外源Na2SeO3濃度之間有弱的正相關性（r＝0.128），并在Na2SeO3濃度為3 μg/mL 時達到最大（5.23 μg/g）。

3 討論

亞硒酸鈉是最常用的富硒劑[14]，多用于對動物[15]和植物[16]的研究，將其用于真菌則多作用于酵母[17]和大型的食用真菌[18]，但是亞硒酸鈉有毒，使用受到一定的限制。亞硒酸鈉對于產菌核（主要是微菌核）真菌的富硒培養研究還未見報道。

本試驗結果表明，在MEA 培養基中添加不同濃度的硒，類胡蘿卜素、酚類化合物和硒均可以在PT95菌株和Q1 菌株的菌核內積累，且可以使2 株菌株菌核的類胡蘿卜素和硒含量得到不同程度的提高，但卻不能使總酚的含量提高。此外，當培養基中Na2SeO3的濃度為10 μg/mL 時，有利于2 株菌核提取物還原力的提高；除Na2SeO3的濃度為10 μg/mL時有利于Q1 菌株菌核提取物DPPH 自由基清除能力的提高外，其余條件下生長的2 株菌株菌核提取物的DPPH 自由基清除能力均不能提高。添加不同濃度的硒均不利于2 株菌核提取物亞鐵離子螯合能力的提高。因此認為，添加硒可能會改變抗氧化系統中各種抗氧化物質之間的比例，從而使各指標之間出現差異。