基于高通量測序技術的玉米不同生育時期土壤細菌多樣性變化

李 丹，靳鯤鵬，李小霞，韓文清，曹晉軍，劉永忠，李萬星

（山西省農業科學院谷子研究所，山西長治046011）

土壤微生物的種類繁多、數量龐大，是土壤生態系統的重要組成部分[1-3]。土壤細菌通過參與土壤有機質的分解、腐殖質合成和養分循環等物質循環和能量流動過程，從而影響著植物的生長發育[4-6]。結構合理、循環良好的土壤生態系統是保證玉米高產、穩產的前提，而關于玉米生長過程中細菌群落結構變化的研究較少。

傳統研究土壤微生物的方法存在一定的局限性，如平板計數法就忽略了不可培養微生物、擴大了生長速度等問題，使得研究微生物多樣性及群落結構成為一個難題。隨著高通量測序技術的發展，其憑借耗時少、通量高、能較為準確地反映微生物在土壤中的群落分布等優勢，使微生物研究更為深入[7]。

本試驗采用高通量測序技術測定玉米4 個關鍵生育時期細菌的多樣性，從而了解玉米不同生長期細菌的群落特點及變化規律，旨在為玉米高產、穩產創造健康的土壤環境，為后續的科學施肥、土壤質量的評價提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于山西省農業科學院谷子研究所內試驗田。該試驗田土壤類型為壤土，前茬作物為玉米。

1.2 試驗材料采集

于玉米苗期（SG1）、大口期（SG2）、抽雄期（SG3）和成熟期（SG4）隨機采集0～20 cm 表層土壤，每個時期取10 個點混合，混合均勻后過2 mm篩，處理好的樣品分成2 份，一份寄送到北京百邁克生物科技有限公司（http：//www.biomarker.com.cn/）進行微生物多樣性測序；另一份包入無菌錫箔紙放入液氮中速凍，隨后帶回實驗室放入-80 ℃保存備用。

1.3 試驗方法

委托北京百邁客生物科技有限公司對土壤樣品進行總DNA 的提取、純化并構建玉米不同生育期土壤細菌的cDNA 文庫；然后利用雙端測序的方法對土壤細菌的16S rRNA V3＋V4 區進行Illumina（Hiseq 2500 高通量測序技術）測序。

1.4 測序數據分析

使用FLASH v1.2.7、Trimmomatic v0.33、UCHIME v4.2 等軟件，對每個樣品的原始序列進行拼接、過濾以及去除嵌合體，最終得到有效數據。

使用QIIME[8]（version 1.8.0）軟件中的UCLUST[9]對Tags 在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTU；并基于Silva（細菌）分類學數據庫對OTU 進行分類學注釋，并統計各生育時期的群落組成。

使用Mothur 1.30 軟件對細菌多樣性指數進行評估。

2 結果與分析

2.1 測序與序列組裝

經Illumina 測序，共獲得640 139 條測序片段，通過雙端拼接、過濾后，共產生496 774 條有效序列。在97%的相似度水平下進行聚類分析，結果共獲得3 976 個OTU。稀釋曲線（Rarefaction curve）是用來驗證各樣本測序數據量是否充分以及數據量是否能夠反映樣品中的多樣性。本試驗4 組樣品的稀釋曲線均逐漸趨于平緩（圖1），說明樣品基本合理，能夠較真實地反映土壤樣本中的細菌群落。

2.2 不同生育時期土壤細菌Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性（Alpha diversity）有多種衡量指標，即Chao1 指數、Ace 指數、Shannon 指數、Simpson 指數，能夠反映單個樣品物種豐度及物種多樣性。其中，Chao1 指數和Ace 指數是衡量物種豐度即物種數量的多少；Shannon 和Simpson 指數用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，Shannon 指數越大，Simpson 指數越小，說明樣品的物種多樣性越高[10]。覆蓋率越高，表明樣本中物種被測出的概率越高，而沒有被測出的概率越低。

表1 不同生育時期土壤細菌群落多樣性指數比較

隨著玉米生長發育的進程，細菌的豐度和多樣性隨之變化。細菌豐度表現為SG3＞SG1＞SG2＞SG4，多樣性表現為SG1＞SG2＞SG3＞SG4。SG4 時期細菌Ace 指數、Chao1 指數、Shannon 指數均最小，Simpson 指數最大，說明在收獲期土壤豐度最低，多樣性最小；SG3 時期細菌Ace、Chao1 指數均最大，說明在抽雄期土壤豐度最大；SG1 時期Simpson指數最小，Shannon 最大，說明在苗期多樣性最大（表1）。

2.3 不同生育時期土壤細菌群落組成分析

將OTU 所代表的序列與微生物參考數據庫進行比對，得到每個OTU 對應的物種分類信息，進而在各水平統計各樣品群落組成。在玉米不同生育時期的土壤中分別檢測到42，37，39，37 個細菌門，128，119，126，120 個細菌綱，333，312，331，310 個細菌科和514，487，510，478 個細菌屬。

創新律師顧問服務形式。泰安市人大常委會共組建1個律師顧問團和8個律師顧問小組。律師顧問團由5名律師組成，為市人代會會議期間代表履職提供駐會法律服務。組建的8個律師顧問小組分別為全國人大代表、省人大代表和6個縣（市、區）人大代表履職服務律師顧問小組，每個團組設兩名聯系人員，分別由市縣兩級人大常委會和司法行政機關工作人員擔任。人大代表需要法律服務時，可以從公布的律師顧問小組中自由選取律師，也可以通過聯系人隨機選取律師。常委會明確了律師顧問服務的性質和服務期限，服務屬于公益性活動，不收取任何費用；服務期限與人大代表任職期限相同。

門分類水平下，玉米不同生育時期的土壤中檢測到的細菌門數分別為42，37，39，37 個。其中，豐度排名較高的前10 個門分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bcateroidetes）、芽單胞桿菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和螺旋體菌門（Saccharibacteria）（圖2）。

在玉米4 個關鍵生育時期的土壤中，變形菌門是該土壤微生物的優勢類群，約占所發現微生物總數的31%，其次依次是酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、芽單胞桿菌門，其余4 個門豐度較低，均小于5%。

屬分類水平下，玉米不同生育時期的土壤中檢測到的細菌綱數分別為128，119，126，120 個。其中，豐度排名較高的前10 個屬的種類分別是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonadaceae）、芽單胞桿菌屬（Gemmatimonadaceae）、Subgroup-6、H16、噬纖維細菌屬（Cytophagaceae）、黃單胞菌屬（Xanthomonadales）、厭氧繩菌屬（Anaerolineaceae）、Gaiellales、RB41（圖3）；未知種類細菌占據很大比例。

通過Python 語言工具對樣品進行層次聚類（圖4-A），用于判斷各樣品間物種組成的相似性；各樣品屬水平的豐度柱狀圖（圖4-B），用以判斷各樣品間物種豐度的相似性。2 個樣品越靠近，枝長越短，說明2 個樣品的物種組成越相似。4 個樣品中，SG1和SG3 距離最近，說明這2 個時期的土壤中微生物的組成最相似，與SG4 的距離最遠，說明SG4 與其他樣品組成差異最大。

3 結論與討論

門分類水平下，4 個樣品中變形菌門是絕對優勢細菌，其次是酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和芽單胞桿菌門。這與前人研究結果一致。JANGID 等[11]在不同類型的耕作土壤中發現，變形菌門占有絕對優勢。袁紅朝等[12]對稻田的土壤細菌進行了研究，結果發現，變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門是稻田的土壤優勢細菌。其次是放線菌門。劉欣等[13]對大豆不同生育期根際土壤細菌群落研究發現，變形菌門、放線菌門、酸桿菌門是大豆根際的優勢菌門，但是綠彎菌門含量較少。而本研究中，綠彎菌門含量較多，且其余菌群比例與在以往研究中菌群比例也不相同，這可能與植物的種類、所處地理因素引起的多樣性、與植物的營養關系等因素有關。其中，酸桿菌可降解植物病殘體多聚物，參與鐵循環，具有光合和反硝化能力[14]，對穩定生態系統發揮著重要作用[15-16]；放線菌可參與土壤結構的形成，土壤中有機質的轉化，植物生長素和抗生素的分泌[17]；綠彎菌是活性污泥的組成成分之一[18]，有利于降解土壤中的有毒物質，在營養較低環境中適宜生長[19]；硝化螺旋菌作為硝化作用第一階段的細菌，可將氨氧轉化成亞硝酸。單胞菌門適合在環境干燥的土壤中生存[20]；變形菌門、浮霉菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門喜好營養豐富的土壤環境；還有絕大多數細菌未能進行分類、培養，其生物學功能不明確，后續需加強對其研究。

在玉米的整個生育期進程中，土壤中細菌多樣性隨著時間的變化而變化。細菌豐度由大到小排序為SG3＞SG1＞SG2＞SG4，多樣性由大到小為SG1＞SG2＞SG3＞SG4。細菌豐度在抽雄期最大，其次依次是苗期、大口期，最后是成熟期。細菌多樣性在苗期最大，然后依次遞減，在成熟期最小。說明在玉米發育過程中，隨著溫度、水分、營養等因素的變化，一些適應環境的細菌數量增加，不適應環境的細菌數量在減少。在苗期，溫度適宜，土壤營養最為豐富，使得細菌多樣性最大；在成熟期，溫度降低，營養減少，使得土壤細菌多樣性與豐度最低；在大口期，適宜生長的細菌大量繁殖，使得豐度上升。

本研究運用高通量測序技術探究玉米4 個不同關鍵生育時期土壤細菌群落結構變化，通過分析4 個不同生育時期的土壤可知，苗期多樣性指數最高，成熟期最低，表明玉米的生育時期對土壤細菌群落結構有一定影響。本研究為更深入了解玉米細菌群落結構多樣性及群落結構的變化提供了理論依據。