芝麻莖點枯病菌產生的幾種細胞壁降解酶活性分析

高樹廣，徐博涵，張春花，王瑞霞，趙 輝，倪云霞，劉紅彥，楊光宇，李偉峰

（1.周口市農業科學院，河南周口466001；2.河南省農業科學院植物保護研究所，河南鄭州450002）

芝麻是最古老的油料作物之一[1]，在溫帶、熱帶地區廣泛種植[2-3]，但是芝麻單產不穩定，除受遺傳因素影響外，病、蟲、草等生物因子或漬、旱等非生物因子的脅迫，也是造成芝麻單產低而不穩的重要因素[4-5]，其中，莖點枯病是世界范圍內危害芝麻最嚴重的土傳、種傳真菌病害之一，在我國常年發病率20%左右，發病嚴重的田塊達到80%以上，重病田幾乎顆粒無收，不但影響芝麻的產量和品質，而且嚴重影響芝麻生產的機械化[6-7]。芝麻莖點枯病菌為菜豆殼球孢，學名Macrophomana phaseolina（Tassi），Goid.），簡稱M. phaseolinna，抗逆能力很強[8]，寄主廣泛，能侵染芝麻、大豆、向日葵、玉米、大豆、煙草、蓖麻、番茄、棉花等500 多種作物[9-10]。

植物病理學認為，細胞壁降解酶是病原菌“基本的親和因子”，它們是病菌侵染、擴展、從植物中獲取營養所必需的，不同的病原菌在致病過程中分泌的細胞壁降解酶種類和作用不同，多種細胞壁降解酶協同作用，是病原真菌降解宿主組織的重要機制。陳捷等[11]研究表明，玉米莖腐病菌產生的細胞壁降解酶在胚根組織的降解中起重要作用；水稻紋枯病菌通過產生的多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶和纖維素酶侵染水稻葉鞘[12]。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素、木質素、果膠和蛋白質等構成[13]，半纖維素和木質素在高等植物細胞中分布廣泛，二者通過共價結合包裹纖維素，形成穩固的超分子體系，此分子體系不但增強植物體的機械強度，而且能防止有害生物和過多水分滲入細胞壁，起到保護和支持作用。木質素主要分布在胞間層和次生內壁，作為纖維素外圍基質，保護纖維素免受降解酶進攻和微生物襲擊。木質素降解的胞外酶主要包括漆酶（Lac）、錳過氧化物酶（MnP）、木質素過氧化物酶（LiP）及一些輔助酶[14-15]。半纖維素是一種異質多聚體，由不同類型的五碳糖和六碳糖構成，木聚糖是主要的組成成分。半纖維素酶是木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶和阿拉伯半乳糖酶等多組酶的總稱[16]。陳曉林等[17]研究表明，細胞壁降解酶是蘋果腐爛病菌的主要致病因子，致病性強的菌株木聚糖酶活性顯著高，并且酶活力峰值出現也比較早。目前，國內外對莖點枯病癥狀的描述、發生規律和防治方法等研究較多，而對病原菌致病機制的研究相對薄弱[18-20]，因此，明確芝麻莖點枯病菌產生的細胞壁降解酶種類及活性，對進一步研究芝麻莖點枯病菌與寄主的互作機制具有重要意義。

本試驗通過測定芝麻莖點枯病菌產生的纖維素降解酶種類及活性大小，為芝麻莖點枯病菌侵染寄主的機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 7 株芝麻莖點枯病菌均由河南省農業科學院植物保護研究所生物防治研究室分離和保存（表1）。

表1 供試菌株

1.1.2 試劑與儀器 木糖、木聚糖、藜蘆醇和ABTS購自北京索萊寶生物科學技術有限公司，均為色譜純；pH 計為Sartorius PB-10，分光光度計為島津紫外分光光度計-UV2450。

1.1.3 培養基 芝麻稈粉：芝麻稈洗凈、蒸餾水沖洗2 遍，80 ℃烘干，粉碎至0.177 mm，2 mol/L NaOH溶液（固液質量比為1∶4）處理12 h，水洗至pH 中性，烘干備用[21]；液體發酵培養基：芝麻稈粉20 g，NH4Cl 2.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Na2HPO40.2 g，CuSO4·5H2O 0.007 g，MnSO40.035 g，FeSO4·7H2O 0.007 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值調至6.8～7.0[22]；DNS 試劑：6.5 g 3，5- 二硝基水楊酸溶于少量蒸餾水中，加入325 mL 2 mol/L 的NaOH 溶液、45 g 丙三醇，搖勻冷卻后定容至1 000 mL[23]。

1.2 方法

1.2.1 木糖標準曲線 取7 支潔凈的10 mL EP 管分別加入一定體積的2 mg/mL 的木糖標準溶液，不加標準溶液為空白對照，ddH2O 定容至2 mL，配制成木糖梯度濃度溶液，搖勻后分別加入2 mL DNS 溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷至室溫，在540 nm波長下測定吸光度（OD值），以木糖質量濃度（mg/mL）為縱坐標、對應的吸光度為橫坐標，繪制木糖標準曲線。

1.2.2 粗酶液制備 將斜面保存的菌株接至PDA平板上，30 ℃黑暗培養2 d，從菌落邊緣打菌餅轉至新的PDA 平板上，30 ℃培養2 d，菌落邊緣打菌餅（直徑為6 mm）轉接至含200 mL 液體發酵培養基的500 mL 錐形瓶中，30 ℃，160 r/min 振蕩培養，以不接菌的液體發酵培養基作為空白對照，3 次重復，每次取樣8 mL，4 ℃，10 000 r/min 離心10 min，上清液即為粗酶液[24]，采用3，5- 二硝基水楊酸法（DNS法）測定酶活力。

1.2.3 木聚糖酶活測定 潔凈干燥10 mL EP 管中加入1.5 mL1%木聚糖緩沖液，然后加入酶液0.5 mL，50 ℃水浴中保溫30 min，反應完畢后，立即取出，加入2 mL DNS 溶液終止酶反應。充分搖勻后沸水浴5 min，冰浴冷卻，在540 nm 波長下測定OD 值，從第2 天開始，每隔1 天測定一次。根據OD 值，在標準曲線上查找木糖濃度，再根據木糖濃度計算出相應的酶活力。酶活力單位（U/mL）定義為：1 mL 酶液1 min 催化底物水解生成1 μmol 木糖[24]，酶活力計算公式如下。

酶活力（U）＝木糖質量濃度（mg/mL）×反應液體積（mL）×6.67（μmol/mg）/反應液中加入酶液體（mL）×時間（min） （1）

其中，6.67 為1 mg 木糖的μmol 數。

1.2.4 木質素降解酶活測定 木質素過氧化物酶（LiP）測定：病原菌液體發酵培養14 d 制取粗酶液，藜蘆醇法[25]測定木質素過氧化物酶活力，2.6 mL反應液（80 mmol/L、pH 值3.0 的酒石酸鈉緩沖液，5 mmol/L 藜蘆醇）中加入0.3 mL 酶液，首先預熱至37 ℃，往此反應液中加入0.1 mL 10 mmol/L H2O2啟動酶促反應，測定310 nm 吸光度在2 min 內的變化。單位時間內1 mL 酶液使反應體系吸光度增加0.01 定義為1 個酶活力單位（U）。

錳過氧化物酶（MnP）測定：病原菌液體發酵培養14 d 制取粗酶液，二價錳氧化法測定錳過氧化物酶活力[26]，在4.0 mL 反應體系中，含有3.4 mL 50 mmol/L乳酸鈉緩沖液（pH 值4.5）、0.1 mL1.6 mmol/L 硫酸錳溶液，酶液0.4 mL，預熱至37 ℃，然后加入0.1 mL1.6 mmol/LH2O2溶液啟動酶促反應，240 nm處測定最初4 min 內吸光度的變化。單位時間內1 mL酶液使反應體系吸光度增加0.01 定義為1 個酶活力單位（U）。

漆酶（Lac）測定：病原菌液體發酵培養14 d 制取粗酶液，ABTS 法測定漆酶活力[27]，在4.0 mL 反應體系中含有0.3 mL 0.3 mmol/L 的ABTS、3.65 mL 檸檬酸- 磷酸鹽緩沖液（pH 值2.6），酶液0.05 mL，混合后在420 nm 處測定最初5 min 內吸光值的變化。每分鐘吸光值變化0.01 單位所需要的酶量為一個Lac 酶活力單位。

1.3 數據分析

采用SPSS 17.0 對試驗數據進行統計分析，Duncan 新復極差法進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 木糖標準曲線繪制

以吸光度為橫坐標、木糖質量濃度為縱坐標繪制標準曲線，得到木糖對應線性方程為y＝0.165 4x＋0.001 6（R2＝0.999 9）（圖1），標準曲線線性關系良好，可用于酶活力測定。

2.2 木聚糖酶活分析

從圖2 可以看出，接種第2 天就有一定的產酶量，取樣7 次，7 株病原菌均能檢測到木聚糖酶，表明7 個菌株均能分泌胞外降解木聚糖的酶。各菌株酶活性均高于第2 天測定結果，并且達到峰值的時間不同（表2），其中，2010003 達到峰值所用時間最短，在第6 天達到峰值，其余菌株在第12 天出現峰值，其峰值大小依次是2010082＞2010003＞2010028＞2010032＞G243＞2010010＞2010064，其中，2010082峰值最大（2.538），2010064 峰值最小（1.533）；參照病害嚴重度進展曲線下面積（AUDPC）法計算酶活性發展曲線下面積（the area under enzyme activity progresscurve，AUEAPC，簡稱A值），7 個菌株A值[28-29]差異極顯著，從大到小依次為2010003＞2010082＞2010028＞2010032＞G243＞2010010＞2010064，其中，2010003 的A 值最高（26.634），2010064 的A 值最低（16.130）。

表2 芝麻莖點枯病菌木聚糖酶活力峰值和A 值差異比較

2.3 木質素降解酶活性分析

木質素降解酶測定結果顯示，7 株病原菌都能檢測到木質素過氧化物酶和漆酶，但均未檢測到錳過氧化物酶。同一菌株不同酶相比較，木質素過氧化物酶活性都明顯高于漆酶活性（圖3）；對不同菌株木質素過氧化物酶、漆酶進行多重比較，結果表明，菌株2010028 的木質素過氧化物酶活性（3.522）和漆酶活性（0.783）均最高，G243 的木質素過氧化物酶活性最低（0.656），2010082 的漆酶活性最低（0.099）（表3）。

表3 芝麻莖點枯病菌木質素降解酶活性不同菌株之間多重比較

3 討論

研究病原菌的致病因子是明確其致病機制和探索植物抗病途徑的重要基礎，大多數植物病原菌都能分泌各種細胞壁降解酶，不同病原菌分泌細胞壁降解酶種類不同，同一種病原菌不同菌株分泌同一種酶的活力大小也存在差異[30]。試驗結果表明，以芝麻秸稈為唯一碳源的液體培養基，培養不同地區采集的7 株芝麻莖點枯病菌，從培養液中制取的粗酶液中都能檢測到木聚糖酶、木質素過氧化物酶和漆酶，但是未檢測到錳過氧化物酶，說明7 株病原菌都具有降解半纖維素和木質素的能力。7 株病原菌接種第2 天就能檢測到木聚糖酶活性，在培養的14 d 中能持續產生木聚糖酶，并且每天的酶活力不同，出現酶活力峰值的時間不同，以A 值作為木聚糖酶綜合活性高低的依據[31]，不同菌株之間差異顯著，2010003 綜合活性最高，2010064 綜合活性最低；不同菌株木質素降解酶活力差異比較顯著，無論是木質素過氧化物酶活力還是漆酶活力，2010028 都顯著高于其他菌株。同一種酶不同菌株活力大小差異比較顯著，是由于病原菌產生胞外細胞壁降解酶的機制比較復雜，除受底物誘導外，還與基因調控和環境因子有關，作為芝麻莖點枯病菌的致病因子，推測木聚糖酶、木質素過氧化物酶和漆酶在不同菌株入侵、擴展中起作用大小不同。另外，芝麻莖點枯病菌侵染芝麻，除細胞壁降解酶外，還有激素和毒素等因子的共同作用才能致病，是一個復雜的生化過程；同時，病原菌侵染也會激活植物防御酶系統、誘導植物產生抗菌物質來抑制病原菌細胞壁降解酶，以達到抗病的目的[32]。因此，本試驗為芝麻莖點枯病菌與寄主互作機制研究奠定了重要基礎，要徹底明確芝麻莖點枯病菌產生的纖維素降解酶對病原菌入侵寄主、病斑擴展的影響及其致病機制，根據病原菌致病因子鑒定程序，還需將病原菌以及分離純化之后的酶，接種活體芝麻，對病原菌的致病性強弱及致病性強弱與這幾種酶的相關性進行進一步探討[17]。