雞堆型艾美耳球蟲早熟株免疫效力分析及安全性評價

康慧鑫，王 麗，鄭明學，白 瑞，張 黎，張雪松，李瑞琪，郝思源，白 冰

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

雞球蟲病是專性寄生于家禽腸道上皮細胞內的一種寄生蟲病，誘發雞只腸炎并伴有腹瀉，因其多發、危害嚴重、防治困難，造成了巨大的經濟損失[1-3]。在已知的9 種雞球蟲中，堆型艾美耳球蟲流行率最高，分布廣泛，致病性較強，養殖中以混合感染常見[4-5]。

目前雞球蟲病仍以藥物防治為主，但蟲株的耐藥性以及因藥殘而引起的食品安全問題[6-9]日趨嚴重。在治療傳染病時，最有效的方法之一就是接種疫苗以誘導保護性免疫[10]，疫苗免疫具有無殘留、效果確實、一次免疫終生保護等優點[11]。目前，商用的雞球蟲病疫苗有強毒活疫苗和弱毒活疫苗，由球蟲親本株制備的強毒活疫苗雖免疫效果良好，但因其致病力強、安全性差，易引起球蟲病暴發；而由球蟲親本株選育出的早熟弱毒球蟲疫苗因其安全性高、免疫效果好，得到廣泛推廣應用[12-14]，故早熟選育弱毒株仍是雞球蟲病疫苗的主要研究方向。

山西農業大學動物科技學院獸醫病理實驗室已獲得免疫原性良好、遺傳穩定[15]的雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）早熟株，其二次免疫的最小免疫劑量為首免1 羽份（400 個/羽），二免2 羽份（800 個/羽）[16]。作為弱毒疫苗蟲株之一，Eimeria acervulina 早熟株的最小首免日齡、二次免疫間隔時間及安全性如何還有待研究。

本試驗對Eimeria acervulina 早熟株進行效力試驗、實驗室安全性試驗等基礎性研究，為雞球蟲早熟株疫苗研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 蟲株

雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）早熟株（Eap20，PAsx）和強毒株（Ea02，Asx）由山西農業大學動物科技學院獸醫病理實驗室保存并提供。

1.2 試驗動物

供試雞為1 日齡SPF 雛雞，由北京梅里亞維通試驗動物技術有限公司提供SPF 種雞蛋孵化而來。

1.3 Eimeria acervulina 早熟株免疫效力試驗

1.3.1 最小首免日齡篩選試驗 將體質量相近的120 只1 日齡SPF 雛雞隨機分為12 組，每組10 只雞，分別為Eimeria acervulina 早熟株（PAsx）免疫攻毒組T1～T4、攻毒對照組C1～C4 和空白組C01～C04。T1～T4 組分別以1 羽份[16]于第1，2，4，6 日齡首免，首免后10 d 以2 羽份二免。二免后14 d 空腹稱質量，對T1～T4 和C1～C4 組經口接種20 萬個卵囊/羽強毒株（Asx）。攻毒第8 天各組雞只稱質量、剖檢，進行十二指腸病變記分、卵囊排出量測定，計算相對增質量率、病變記分減少率（RLS）、卵囊減少率和抗球蟲指數（ACI），來篩選其作為疫苗蟲株使用的最小首免日齡。

1.3.2 免疫間隔期篩選試驗 將150 只體質量相近的1 日齡SPF 雛雞隨機分為15 組，每組10 只雞，分別為免疫攻毒組TA1～TA5、攻毒對照組TB1～TB5 和空白組CA1～CA5。于4 日齡用400 個孢子化卵囊/ 羽PAsx 對TA1 ～TA5 組首免，間隔3，5，7，9，11 d 進行二免。二免后第14 天稱質量，對TA1～TA5 和TB1～TB5 組經口接種20 萬個卵囊/羽Eimeria acervulina 強毒株，攻毒后觀察和測定指標同1.3.1，確定疫苗蟲株2 次免疫的免疫間隔期。

1.4 Eimeria acervulina 早熟株實驗室安全性試驗

1.4.1 一次單劑量接種 將體質量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機分為2 組，每組10 只雞，接種組TC1組接種PAsx 疫苗蟲株推薦免疫劑量的1 羽份/只疫苗蟲株，CC1 組為空白對照組。觀察各試驗組雞臨床癥狀及死亡雞數，于接種后第14 d 稱質量、剖檢，觀察各器官病理變化，進行十二指腸平均病變記分，計算相對增質量率。取各組雞的肝、腎、心、十二指腸、小腸中段制作組織切片，進行病理組織學檢查。

1.4.2 單劑量重復接種 將體質量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機分為2 組，每組10 只雞，接種組TD2組接種PAsx 疫苗蟲株，CD2 組為不接種空白對照組。接種組于14，28 日齡分別以疫苗蟲株推薦免疫劑量1 羽份/只、2 羽份/只接種，隔離飼養。試驗期和觀察指標同1.4.1。

1.4.3 一次超劑量接種 將體質量相近的4 日齡SPF 雛雞隨機分為6 組，每組10 只雞，接種組TE3、TE4、TE5、TE6（接種蟲株同TC5 組）組分別接種20倍（16 000 個卵囊/只）二次免疫推薦使用劑量的三批PAsx 疫苗蟲株，CE3、CE4 組為不接種空白對照組，隔離飼養。TE3、TE4、TE5 組和CE3 組試驗期和觀察指標同1.4.1。TE6 組和CE4 組于接種后第7 天稱質量、剖檢，進行平均病變記分并計算相對增質量率。

1.5 判定指標

相對增質量率＝感染組雞平均增質量/健康對照組雞平均增質量×100% （1）

死亡率=組內死亡雞數/組內總雞數×100% （2）

OPG 是指1 g 糞便中含有的卵囊數目；腸道病變記分、十二指腸的病變記分參照JOHNSON 等[17]、蔡秀敏[4]的方法。

RLS＝（不免疫攻毒組的平均病變記分－免疫攻毒組的平均病變記分）/不免疫攻毒組的平均病變記分×100% （3）

卵囊減少率＝（不免疫攻毒組卵囊平均產量－免疫攻毒組卵囊平均產量）/不免疫攻毒組卵囊平均產量×100% （4）

ACI＝（存活率＋相對增質量率）×100－（病變值＋卵囊值）[17]（5）

免疫效果判定標準：綜合分析各項指標，將死亡率為0、相對增質量率≥80%、十二指腸病變記分≤1、RLS≥70%、卵囊減少率≥75%和ACI≥180判定為免疫效果良好。

1.6 數據處理

試驗結果用SPSS 17.0 統計學軟件進行方差分析，并用Prism 6.0 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 Eimeria acervulina 早熟株效力試驗研究

2.1.1 最小首免日齡篩選試驗 各免疫攻毒組雞群的精神狀態良好，未見死亡，TI～T4 組的相對增質量率、卵囊減少率、病變記分減少率、抗球蟲指數均逐漸增高，與首免日齡呈正相關。T3、T4 組相對增質量率均≥97.7%，平均病變記分≤0.8，RLS≥77.1%，卵囊減少率均≥95.0%，抗球蟲指數均≥189.7，達到良好免疫效果（圖1）。

2.1.2 不同免疫間隔期對免疫效力的影響Eimeria acervulina 早熟株以最小免疫劑量接種雛雞，2 次免疫間隔在3～11 d，隨著二次免疫間隔時間的延長，免疫攻毒組雞的相對增質量率、卵囊減少率、病變記分減少率、抗球蟲指數升高。TA1～TA5 組病變記分均＜1，且差異不顯著（P＞0.05），RLS 均≥85.3，ACI 均≥182.4，卵囊減少率均≥90%，但免疫攻毒TA1、TA2 組平均增質量極顯著低于TA3、TA4、TA5 組（P＜0.01）（圖2）。

2.2 Eimeria acervulina 早熟株安全性試驗

2.2.1 一次單劑量接種 試驗雞群精神狀態良好，死亡率為0。第14 天剖檢，各腸道未見眼觀病變，病變記分為0.0，接種組雞只的相對增質量率大于80%（圖3）。

鏡檢發現，接種雞十二指腸絨毛上皮細胞少量脫落，十二指腸和空腸均可見發育不同階段的蟲體，其余組織均未見異常。

2.2.2 單劑量重復接種 試驗雞群精神狀態良好，死亡率為0。重復接種14 d 后剖檢雞只，各腸道均無眼觀病變，病變記分為0.0，對照組也未見眼觀病變（圖3）。

鏡檢發現，試驗雞十二指腸腸腔結構較完整，絨毛上皮細胞少量脫落；十二指腸和空腸均可見發育不同階段的蟲體，其余組織均未見異常。

2.2.3 一次超劑量接種 三批疫苗蟲株16 000 個卵囊/只劑量接種組，雞只精神狀態未見異常，死亡率為0；第7 天剖檢發現，個別雞十二指腸黏膜有少量散在白色結節，平均病變記分為1.0，其他腸道未見明顯眼觀病變；14 d 后剖檢發現試驗組與對照組雞只各腸段均無明顯眼觀病變，平均病變記分為0（圖3）。

鏡檢發現，第7 天剖檢雞只十二指腸大量腸絨毛從基底部斷裂，絨毛上皮細胞大量脫落；接種后14 d 雞只十二指腸部分絨毛斷裂，絨毛上皮細胞大量脫落；第7 天與第14 天剖檢雞十二指腸和空腸均可見發育不同階段的蟲體，其余組織均未見異常。

3 討論

弱毒活疫苗是依據活卵囊脫囊后在腸道內周期性繁殖來獲得免疫保護，因此，免疫日齡的選擇也是其免疫是否成功的關鍵一步。首免日齡不宜過小或過大，球蟲脫囊需借助足夠的膽汁和胰凝乳蛋白酶以及肌胃的機械碾磨，接種日齡過小時，其肌胃、腸道機能不完善，致使其無法進行內生性發育以刺激雞體產生免疫反應；接種日齡過大，可能造成在免疫保護力產生前就已感染外界野毒。

張龍現等[18]研究發現，EimerCox plus 雞球蟲活苗最適免疫日齡為5 日齡。本試驗結果表明，隨首免日齡增大，各試驗組的相對增質量率、卵囊減少率、RLS、ACI 逐漸增高，4～6 日齡首免均可取得良好的免疫效果，以4 日齡為最小首免日齡。

球蟲病康復雞對再感染有抵抗力[19]，但若缺乏再感染，隨時間延長，雞對球蟲的免疫力會減弱；使用一定數量卵囊對雞進行免疫時，小劑量反復接種的免疫效果優于一次大劑量接種[20]，這是因為免疫次數少，產生的免疫滴度低，不能很好的預防球蟲病發生，而二次免疫可使抗體水平迅速提高，且免疫產生的抑制期較短。本試驗將免疫間隔選擇在3 d以上，結果表明，隨著免疫間隔時間的增加，免疫攻毒雞的相對增質量率、病變記分減少率、抗球蟲指數均呈上升趨勢，可見在最適時間進行二次免疫，對雛雞有促生長作用，并可增強免疫力。本試驗結果表明，雖然二免間隔3～11 d 均可達到良好的保護效果，但二免間隔3～5 d 的攻毒組雞的相對增質量明顯低于間隔7 d 以上的二免組，故將二免間隔定為7 d。

一次單劑量、單劑量重復和一次超劑量接種試驗結果表明，接種雞十二指腸絨毛斷裂數量與接種劑量呈正相關，但重復接種時，雞體已獲得一定免疫力，所以，損傷相對要小；一次超劑量接種組個別雞十二指腸損傷較嚴重，這是由于大量蟲體在腸道內行裂殖生殖，腸黏膜原有結構被嚴重破壞，腸黏膜上皮細胞局灶性壞死、脫落，并進行炎癥反應來抗損傷。三次安全性試驗中，雞只未見死亡，精神狀態良好，除20 倍劑量接種組個別雞只腸道損傷嚴重外，其余各組雞只腸絨毛完整，無血管破裂現象，雞群平均病變記分均≤1，相對增質量率均在80%以上。說明本疫苗蟲株對健康雛雞均安全，符合安全性要求。