醬油渣中乳酸乳球菌分離鑒定及對模擬胃腸環(huán)境的耐受性

黃桂東 唐素婷 程云輝 孫張樂 陳梓琦 焦 葉 張 燦 鐘先鋒

(1. 佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528231；2. 廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；3. 廣東省食品流通安全控制工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；4. 佛山市釀造工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；5. 佛山農業(yè)生物制造工程技術研究中心，廣東 佛山 528231；6. 長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114；7. 開平市佰益飼料科技發(fā)展有限公司，廣東 江門 529300)

醬油釀造是多種微生物協同作用的結果，每種微生物對醬油釀造過程的成分變化乃至醬油品質優(yōu)劣均有一定影響[1-3]。醬油釀造過程涉及的微生物有曲霉、乳酸菌、酵母菌等[4]，其中，乳酸菌是參與醬油釀造最重要的細菌，主要包括乳桿菌屬[5]、乳酸乳球菌屬[6]、魏斯氏菌屬[6]、片球菌屬[4,6]等。醬油渣是醬油釀造后產生的殘渣，攜帶一定種類和數量的微生物，如乳酸乳球菌等[5-6]。目前大多數報道集中于對醬油釀造過程中乳酸菌的研究，查閱中國知網數據庫和Pubmed數據庫，尚未見有關醬油渣中乳酸乳球菌的報道，對醬油渣中乳酸菌的認識不足。

近年來，乳酸乳球菌因其良好的益生特性被廣泛應用于食品行業(yè)。部分乳酸乳球菌及其亞種能產生乳鏈菌肽[7-8]，是無毒的食品防腐劑，可用于食品防腐及保鮮[9]；乳酸乳球菌還可產胞外多糖，用于干酪[10]和豆腐[11]制作，其代謝產物能夠改善產品的流變學特性等。

為了深入挖掘乳酸菌資源并延伸醬油渣的可利用價值，試驗擬采用傳統(tǒng)菌株篩選方法，從醬油渣中分離、篩選、鑒定乳酸乳球菌，并對其部分益生特性進行研究，以期為食源性乳酸菌資源庫擴充提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

醬油渣：原料主要是大豆與小麥粉，采用高鹽稀態(tài)工藝釀造，廣東某調味食品有限公司;

過氧化氫生化鑒定管、革蘭氏染色試劑盒、硫化氫生化鑒定管、吲哚生化鑒定管、硝酸鹽(還原)生化鑒定管、明膠生化鑒定管、MRS肉湯等：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

防凍霜冰箱：BCD-189WDPV型，海爾股份有限公司；

顯微鏡：PH100型，鳳凰光學集團有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：LRH-150型，上海一恒科學儀器有限公司；

全自動滅菌鍋：GR60DA型，致微(廈門)儀器有限公司；

電子分析天平：ME104型，梅特勒—托利多精密儀器公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醬油渣中乳酸菌的分離與純化 根據文獻[12-14]修改如下：稱取醬油渣樣品10 g溶解于90 g無菌生理鹽水中，制成10-1,10-2,……,10-6共6個濃度稀釋液。吸取稀釋液0.1 mL，涂布于含3 g/100 mL碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃倒置培養(yǎng)24～36 h。挑取菌落劃線2～3次至菌落一致。挑取單菌落37 ℃培養(yǎng)12 h，與甘油混合，-20 ℃保藏。

1.2.2 醬油渣中乳酸菌的鑒定

(1) 形態(tài)學觀察：根據文獻[15]修改如下，菌株劃線培養(yǎng)于MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株的菌落形態(tài)。進行革蘭氏染色試驗，使用油鏡，觀察菌株的菌體形態(tài)。革蘭氏陽性菌株進行過氧化氫酶接觸試驗，有氣泡產生為陽性反應，無氣泡產生為陰性。

(2) 生理生化試驗：參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[16]，具體試驗操作參考生化鑒定管說明書。

(3) 分子生物學鑒定：將革蘭氏呈陽性、過氧化氫酶接觸試驗呈陰性菌株送往華大基因進行菌株的16S rRNA 序列測序。

(4) 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建：根據文獻[17-18]修改如下，登陸GenBank中BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比對測序菌株，并查詢模式菌株信息，利用Mega 5.0軟件，使用鄰近算法，BacillussubtilisNCDO1769為外群菌株，bootstrap為1 000構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 乳酸乳球菌生長曲線測定 根據文獻[19]修改如下：菌株活化3代，調節(jié)OD600 nm為(1.00±0.05)，按照2%(體積分數)的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為陰性對照，分別培養(yǎng)0，2，4，6，8，10，12，16，20，24，28，32，36，40 h，使用酶標儀測定菌株的OD600 nm，記錄數據并繪制生長曲線。

1.2.4 乳酸乳球菌模擬胃液耐受性測定 根據文獻[12,20]修改如下，菌株活化3代，吸取4 mL菌液，5 000 r/min 離心8 min，去上清液，將菌體懸浮于4 mL滅菌生理鹽水制成菌懸浮液。無菌離心管中加入4.5 mL人工胃液、0.5 mL菌懸浮液，混合均勻。37 ℃培養(yǎng)，分別在0(稀釋度為10-4，10-5，10-6)，3 h(稀釋度為10-3，10-4，10-5)取樣0.1 mL，使用平板計數法計算菌株存活率。設置3個平行，按式(1)計算菌株存活率。

(1)

式中：

S1——菌株存活率，%；

A0——耐受人工胃液0 h的活菌數，CFU/mL；

A1——耐受人工胃液3 h的活菌數，CFU/mL。

1.2.5 乳酸乳球菌模擬腸液耐受性測定 根據文獻[12,20]修改如下，取人工胃液消化3 h的菌株培養(yǎng)液0.5 mL，接種于4.5 mL人工腸液中，37 ℃培養(yǎng)0(稀釋度10-3，10-4，10-5)，4 (稀釋度10-2，10-3，10-4)，8 h(稀釋度10-2，10-3，10-4)，使用平板計數法計算菌株存活率。設置3個平行，按式(2)計算菌株存活率。

(2)

式中：

S2——菌株存活率，%；

A0——人工腸液耐受0 h的活菌數，CFU/mL；

As——人工腸液耐受4 h或8 h的活菌數，CFU/mL。

1.3 數據處理

數據統(tǒng)計與處理采用Excel 2013以及SPSS 17.0，繪圖采用Origin 9。

2 結果與分析

2.1 乳酸乳球菌形態(tài)學觀察

從醬油渣中分離得到4株乳酸乳球菌，分別為菌株HT122、HT127、HT223、HT227，菌落顏色為灰白色，菌落表面光滑，邊緣齊整，直徑為0.3～1.0 mm。經染色試驗發(fā)現4株乳酸菌均為革蘭氏陽性菌，菌體均為球狀，呈單個、成對或短鏈分布。醬油渣中部分乳酸乳球菌的菌體形態(tài)如圖1所示。

圖1 部分乳酸乳球菌菌株的菌體形態(tài)

Figure 1 Microscopic morphology of partialLactococcuslactisfrom soy sauce residue (×1 000)

2.2 乳酸乳球菌生理生化試驗特征

由表1可知，菌株HT122、HT127、HT223和HT227的革蘭氏染色試驗菌體均呈紫色，過氧化氫酶接觸試驗、硝酸鹽還原反應、葡萄糖產氣試驗、6.5% NaCl生長試驗及45 ℃生長試驗均呈陰性。參考雷霞[21]、華鶴良[22]的方法，結合形態(tài)學研究結果，初步判斷以上4株菌為乳酸乳球菌屬(Lactococcus)。

表1 乳酸乳球菌生理生化鑒定結果?Table 1 Results of the biochemical identification of Lactococcus lactis from soy sauce residue

? “+”表示反應呈陽性；“-”表示反應呈陰性、不生長或生長不明顯。

2.3 乳酸乳球菌分子生物學鑒定

對4株乳酸乳球菌進行基因組提取、16S rRNA基因PCR擴增、測序，所得凝膠電泳圖如圖2所示。由圖2可知，4株乳酸乳球菌PCR產物大小均在1 500 bp左右，且條帶清晰無彌散。

得到菌株的16S rRNA基因序列，進行Blast比對，結果如表2所示。利用Mega 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。由圖3可知，菌株HT122、HT127、HT223、HT227均與模式菌株Lactococcuslactissubsp.lactisJCM 5805T、Lactococcuslactissubsp.hordniaeNBRC 100931T處于同一分支。結合表2，將菌株HT127、HT223、HT227鑒定為Lactococcuslactissubsp.hordniae(乳酸乳球菌霍氏亞種)；將菌株HT122鑒定為Lactococcuslactissubsp.lactis(乳酸乳球菌乳亞種)。Ansah[6]研究也發(fā)現醬油發(fā)酵過程中存在乳酸乳球菌。

電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，使用Trans 2K@Plus RNA Marker

圖2 乳酸乳球菌16S rRNA PCR擴增產物電泳圖

Figure 2 Electrophoresis of 16S rRNA amplified products ofLactococcuslactisfrom soy sauce residue

表2 醬油渣中分離菌株的16S rRNA 序列同源性比對結果Table 2 Results of 16S rRNA sequence homology analysis of Lactococcus lactis from soy sauce residue

0.02表示2%替換率

2.4 乳酸乳球菌生長曲線

由圖4可知，從醬油渣中分離得到的4株乳酸乳球菌的生長趨勢總體相似。0～2 h為延遲期，2～12 h 為對數生長期，接種12 h后，菌株生長速率減緩，進入生長穩(wěn)定期。

圖4 乳酸乳球菌菌株生長曲線Figure 4 Growth curves of Lactococcus lactis from soy sauce residue

2.5 乳酸乳球菌模擬胃液耐受能力

胃液主要由黏液、鹽酸、胃蛋白酶組成，在胃液作用下，微生物的活菌數會逐漸減少。由于微生物需要超過一定數量才能對機體發(fā)揮益生特性，因此需要考察乳酸乳球菌的胃液耐受能力[23]。由圖5可知，菌株HT223的模擬胃液耐受能力較好，耐受胃液3 h后，菌株存活率為(94.85±0.05)%；菌株HT127、HT227、HT122耐受胃液3 h后，菌株存活率分別為(81.67±0.25)%，(77.99±0.58)%，(58.57±0.57)%。迪娜熱爾·迪力達西等[24]對從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中分離出的乳酸乳球菌進行胃液耐受能力試驗，發(fā)現其3 h存活率達94.27%。說明不同菌株對人工胃液耐受能力有差異。

圖5 乳酸乳球菌在模擬人工胃液中的存活率

Figure 5 Test results of live bacteria counts ofLactococcuslactisin simulated artificial gastric juice

2.6 乳酸乳球菌模擬腸液耐受能力

腸液主要成分為胰液和膽汁。胰液中的胰蛋白酶可水解微生物的菌體蛋白質，抑制乃至殺死微生物。膽汁中含有一定量膽鹽，膽鹽在人體腸道的濃度為0.03%～0.30%，能改變微生物細胞膜的通透性，抑制、殺死進入腸道的微生物[25]。微生物到達小腸后，因胰蛋白酶、膽鹽的抑制作用及營養(yǎng)的缺乏等因素逐漸死亡[12]。因此，需評估乳酸菌對腸液的耐受能力。由圖6可知，菌株HT127耐受腸液能力較好，耐受腸液4，8 h后的菌株存活率分別為(93.61±0.67)%，(67.42±0.72)%；菌株HT227耐受腸液能力較差，耐受模擬腸液4，8 h的菌株存活率分別為(26.83±0.13)%，(22.28±0.18)%。結合4株乳酸乳球菌模擬胃液耐受能力的結果，發(fā)現菌株HT127耐受模擬胃液、腸液能力較好。

圖6 乳酸乳球菌在模擬人工腸液中的存活率

3 結論

從醬油渣中分離得到了4株乳酸乳球菌，經鑒定，分別屬于Lactococcuslactissubsp.hordniae(乳酸乳球菌霍氏亞種)和Lactococcuslactissubsp.lactis(乳酸乳球菌乳亞種)。對其體外模擬胃腸環(huán)境耐受能力研究發(fā)現，菌株HT127耐受模擬胃腸環(huán)境能力較好。后續(xù)可對其生長特性、益生特性等進行深入研究與探討，為乳酸乳球菌資源庫的豐富提供科學依據。