利用植物揮發(fā)物提升冬季設(shè)施草莓蜜蜂授粉效率

張軍飛，邱一蕾，柴秋子，余紅，李紅亮*

(1.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

草莓(FragariaananassaDuch.)是一種薔薇科植物，果實鮮美，深受廣大群眾喜愛[1]。草莓難以在野外過冬，因而目前冬季草莓以大棚栽培為主，即設(shè)施草莓。大棚內(nèi)環(huán)境相對密閉，濕度大、空氣流動性差，且缺少自然授粉媒介活動，并不利于草莓授粉受精，因此，需要采用人工授粉或者蜜蜂授粉的方法來提高授粉效率[2]。由于人工授粉費時費力，且效果不理想[3]，因此，目前設(shè)施大棚常采用中華蜜蜂授粉的方法來提高草莓的授粉率[4]。

中華蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius，簡稱中蜂)是中國人工飼養(yǎng)規(guī)模最大的蜂種，善于采集零星蜜源，消耗飼料少，易于管理，耐低溫(10 ℃左右仍能正常采集飛行)[5]，是冬季及早春溫度較低狀態(tài)下設(shè)施草莓授粉效果最佳的蜂種之一[6]。為了進一步提高蜜蜂的授粉效果，現(xiàn)有的可實施技術(shù)措施主要從作物栽培與蜂群管理出發(fā)——授粉作物需分布合理并處于良好的生長狀態(tài)，根據(jù)作物情況合理配置與管理授粉蜂群，為蜂群提供作物蜜源的誘導(dǎo)信息，吸引蜜蜂采訪[7]。然而，在實際栽培中很難滿足上述所有條件，因而蜜蜂的授粉效果雖比人工授粉好，但仍未達到最優(yōu)狀態(tài)，也就是說，在蜜蜂的授粉效果上仍有很大的發(fā)揮空間。

在以活框飼養(yǎng)方式為主的傳統(tǒng)養(yǎng)蜂業(yè)中，為了獲取最大經(jīng)濟利潤，蜂農(nóng)往往會在入冬前將蜂群巢蜜割凈，采用飼喂糖水的方式來維持蜜蜂的基本生存[8]。當(dāng)這些中蜂被莓農(nóng)用于其設(shè)施草莓授粉時，用傳統(tǒng)非活框的圓木桶方式飼養(yǎng)，但飼喂方式基本不變。這種噴施糖水的方式給蜜蜂提供了足夠的蜜源，使蜜蜂變得懶惰，長此以往反而會使蜜蜂不愿出去采蜜，從而導(dǎo)致其授粉效率下降。為了有效地提高冬季設(shè)施草莓授粉蜜蜂的活力和授粉效率，停用糖水飼喂方式，通過試驗篩選出花香揮發(fā)物嗅覺活性劑，形成復(fù)合糖水增效劑，通過噴施復(fù)合糖水增效劑，誘導(dǎo)并促進蜜蜂工蜂出巢授粉，提高了中蜂嗅覺敏感性和其出巢、訪花的頻率，延長了單花停留時間，從而提升了授粉效率，為草莓增產(chǎn)增效提供了新途徑。現(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在中華蜜蜂嗅覺活性劑的篩選試驗中，中華蜜蜂為本實驗室內(nèi)人工飼養(yǎng)的種群。在噴施復(fù)合糖水增效劑試驗中，所用中蜂群購自杭州建德山區(qū)，采用常規(guī)的土法圓木桶法養(yǎng)殖。試驗所用草莓品種為豐香，由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所提供。試驗于杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所草莓溫室大棚基地進行。

觸角電位儀由荷蘭Syntech公司生產(chǎn)。β-紫羅蘭酮，3,4-二甲基苯甲醛，苯甲醛，對羥基苯甲酸甲酯(HOB)，E,E-法尼醇，液狀石蠟等化學(xué)試劑均購自百靈威公司(純度>97%)。飼喂蜜蜂的糖水(質(zhì)量分數(shù)25%)，用適量白砂糖溶解于滅菌水中配置而成，煮沸15 min，冷卻后使用。

1.2 中華蜜蜂嗅覺活性劑成分的篩選

試劑及刺激樣品的制備。選擇活性較強的4種植物揮發(fā)物(β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚、3,4-二甲基苯甲醛、苯甲醛)和2種蜜蜂信息素(對羥基苯甲酸甲酯、E,E-法尼醇)進行試驗。分別將供試的各化合物溶于液狀石蠟，并配成10%溶液，在EAG昆蟲觸角電位測量系統(tǒng)上進行測定。劑量反應(yīng)測試時，選擇熒光結(jié)合試驗中具有代表性的化合物，用溶劑作為對照。

觸角電位測定。首先用手術(shù)刀將中華蜜蜂觸角從基部切下，然后小心地將中華蜜蜂觸角的兩端用導(dǎo)電膠分別黏在EAG昆蟲觸角電位測量系統(tǒng)的金屬電極上。觀察顯示屏上的基線變化情況，待基線平穩(wěn)，表明觸角已經(jīng)穩(wěn)定，且反應(yīng)良好，可以開始試驗。

在濾紙條上(2 cm×0.5 cm)滴加10 μL待測樣品溶液，使溶劑揮發(fā)一會兒后，再將濾紙塞進巴斯德管內(nèi)，用錫箔紙把管口兩端封住，防止樣品揮發(fā)。另取10 μL液狀石蠟+濾紙作為空白對照。測試時，將巴斯德管一端插入送氣管外側(cè)直徑2 mm的小孔內(nèi)，送氣管管口與觸角縱向垂直，并與觸角相距1 cm左右。同時點擊手標和踩腳踏板，刺激時間0.2 s，刺激氣流100 mL·min-1，2次刺激相隔2 min，以保證觸角感覺器的感覺功能完全恢復(fù)。隨機測定待測樣品，由于隨著時間延長，觸角的生理活性也會跟著降低，為了避免此種情況對試驗造成不利影響，以體積分數(shù)1%的葉醇-石蠟溶液作為標準參照刺激，對各測試樣品的刺激反應(yīng)進行標準化校正。預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂對葉醇的反應(yīng)存在穩(wěn)定的峰值，所以選擇葉醇作為標準參照。在測定樣品前，先進行1次對照(液狀石蠟)和標準參照刺激，然后測試5個樣品，再進行對照和標準參照刺激，如此循環(huán)往復(fù)，每個觸角約測試5個樣品，每個待測樣品重復(fù)6次。EAG反應(yīng)值的計算公式如下：

式中：S為中華蜜蜂對某化合物EAG反應(yīng)的相對值，Sc為中華蜜蜂對某化合物的EAG反應(yīng)值，Cm為測定此化合物前后的對照2次EAG反應(yīng)的平均值，Rm為測定此種化合物前的標準參照EAG反應(yīng)的平均值。

1.3 復(fù)合糖水增效劑噴施對草莓授粉的效果測定

利用中蜂的自然授粉規(guī)律和嗅覺機理，通過1.2節(jié)試驗篩選和設(shè)計了中蜂嗅覺活性劑成分。試驗時，將溫室大棚3等分，依次作為對照區(qū)、緩沖區(qū)和處理區(qū)。中蜂蜂桶處于緩沖區(qū)的中間點，蜂桶墊高50 cm左右，巢門朝南，待蜜蜂計數(shù)器安裝、調(diào)試完畢后，進行試驗，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。試驗期間溫室均不施用任何除草劑和殺蟲劑，整個過程不飼喂糖水。將經(jīng)篩選的中蜂嗅覺活性劑有效成分與25%的糖水混合，形成復(fù)合糖水增效劑，噴施于處理區(qū)，以25%糖水作為對照，同時記錄同一時間段內(nèi)蜜蜂的活動情況。

1.4 測量指標的定義和數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

在草莓盛花期進行試驗時，將草莓大棚分為一個個規(guī)格2 m×2 m的樣方。當(dāng)中蜂進入樣方訪問第1朵花時開始用秒表計時，離開樣方時停止計時，記錄此間該中蜂訪問的草莓花朵總數(shù)。將每只中蜂工蜂1 min內(nèi)訪問的草莓花總數(shù)定義為蜜蜂的訪花頻率；蜜蜂從接觸一朵花到離開這朵花所經(jīng)過時間定義為單花停留時間。

利用SPSS 16.0軟件對獲得的試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。對EAG反應(yīng)的相對值，做單因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較。針對不同處理的蜜蜂訪花頻率、單花停留時間，用t-test進行檢驗。試驗數(shù)據(jù)用Origin v8.5做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華蜜蜂嗅覺活性劑成分篩選

研究中華蜜蜂對4種植物揮發(fā)物和2種蜜蜂信息素的EAG反應(yīng)，結(jié)果如表1所示。中華蜜蜂工蜂對兩種花香類物質(zhì)(β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚)的反應(yīng)值最大，其次是2種蜜蜂信息素(對羥基苯甲酸甲酯、E,E-法尼醇)，中華蜜蜂工蜂對β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚的嗅覺反應(yīng)顯著強于蜜蜂信息素，且中華蜜蜂工蜂對β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚的EAG反應(yīng)值差異不顯著。結(jié)果表明，β-紫羅蘭酮、甲基丁香酚這2種花香類物質(zhì)更能夠引起蜜蜂的嗅覺反應(yīng)，可以初步確定為嗅覺活性劑的有效成分。

表1 中華蜜蜂對植物揮發(fā)物和蜜蜂信息素的觸角電位反應(yīng)

注：同列數(shù)據(jù)后無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 復(fù)合糖水增效劑噴灑草莓對中蜂訪花頻率和單花停留時間的影響

選擇β-紫羅蘭酮代表植物揮發(fā)物，HOB代表信息素，分別構(gòu)建糖水+嗅覺活性劑的組合。由圖1可以看出，噴施糖水和添加HOB的復(fù)合糖水增效劑后，中華蜜蜂的訪花頻率并沒有顯著變化，但當(dāng)噴施添加β-紫羅蘭酮的復(fù)合糖水增效劑后，中華蜜蜂的訪花頻率較噴施糖水的處理顯著增加。

噴施糖水后，相較于對照(空白)，中華蜜蜂的單花停留時間極顯著延長；噴施添加β-紫羅蘭酮的復(fù)合糖水增效劑后，相較于噴施糖水的處理，中華蜜蜂的單花停留時間極顯著縮短；噴施添加HOB的復(fù)合糖水增效劑后，相較于噴施糖水的處理，中華蜜蜂的單花停留時間無顯著變化。

綜合上述結(jié)果，噴施糖水+β-紫羅蘭酮的復(fù)合糖水增效劑能使蜜蜂的訪花頻率提高20.7%，有效提高蜜蜂的授粉活性，但以糖水+HOB配制的復(fù)合糖水增效劑對中華蜜蜂授粉活性并無顯著影響。

圖中標*或**的分別表示差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。圖1 不同處理對中華蜜蜂訪花頻率和單花停留時間的影響

3 討論

昆蟲利用嗅覺搜尋食物和配偶。對于蜜蜂而言，工蜂的出巢飛行軌跡與植物蜜源地密切相關(guān)。本研究中，中蜂對β-紫羅蘭酮和甲基丁香酚，以及兩種蜜蜂信息素(對羥基苯甲酸甲酯、E，E-法尼醇)的EAG反應(yīng)值較大。β-紫羅蘭酮是一種常見的植物花香類分子[9]。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)其與中華蜜蜂的化學(xué)感受蛋白和氣味結(jié)合蛋白都能夠產(chǎn)生較強的結(jié)合[10]。而且，嗅覺蛋白與這些植物揮發(fā)物成分結(jié)合時，其結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而增加[11]。作為蜂王信息素的一種成分，對羥基苯甲酸甲酯與中蜂的一種信息素結(jié)合蛋白也能夠產(chǎn)生較強的結(jié)合[12]，但與植物性氣味不同的是，這種信息素與信息素結(jié)合蛋白的結(jié)合隨溫度的上升而下降，呈現(xiàn)靜態(tài)猝滅特征[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，糖水和植物揮發(fā)素組合配置的復(fù)合糖水增效劑能有效提升蜜蜂在特殊環(huán)境下的活性，而糖水和信息素組合配置的復(fù)合糖水增效劑卻無此效果。

利用糖水、糖水+β-紫羅蘭酮、糖水+HOB處理草莓樣方，記錄中蜂的訪花頻率和單花停留時間，結(jié)果顯示，糖水+β-紫羅蘭酮的處理較糖水而言，能顯著提高蜜蜂的訪花頻率，從而提高授粉活性，這為破解冬季低溫弱光條件下蜜蜂活性低的問題提供了新的思路。

本試驗中嗅覺活性劑均以糖水作為溶劑，是考慮到糖水具有蜜蜂敏感的食物氣味，以其作為基礎(chǔ)性的氣味源有助于體現(xiàn)嗅覺活性劑的本底活性。本試驗也證明，單獨的糖水僅能延長蜜蜂的單花停留時間，對蜜蜂的訪花頻率并沒有顯著影響，必須加入相應(yīng)的嗅覺活性劑，如β-紫羅蘭酮才能夠提高訪花頻率，從而提高蜜蜂的授粉活性。